ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Summary

この記事では、タマネギ表皮細胞にプラスミドDNAを導入する遺伝子銃をヘリオス適切にBioRad社製を使用する方法を示して、どのように二分子蛍光相補性の原理（BiFC）に基づいて、タマネギの細胞におけるタンパク質間相互作用をテストする

Abstract

多様な生物の遺伝子機能の調査では、遺伝子産物が正常な細胞環境の相互作用についての知識に依存しています。二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Protocol

I.プラスミド調製

砲撃のために使用されるプラスミドDNAは高純度と500ng/μl以上の濃度ででなければなりません。 BiFCは2つのプラスミドコンストラクトを含むために、各プラスミド25μgのが必要です。言い換えれば、2つのプラスミドの1:1のモル比は、カートリッジの準備のために50μgのプラスミドDNAの総を生じさせるために混合されるべきである。 50μgのより多くのDNAを追加すると金粒子の凝集を引き起こす可能性があり、避けるべきであることに留意してください。市販のプラスミドDNA抽出キットは、プラスミドDNAを単離するために推奨されています。

プラスミドベクターは、pUC19のようなサイズが比較的小さいはずです。我々は、それぞれ^3、pUC19を- SPYNE及びpUC19 - SPYCEにSEUとLUH cDNAをクローニングした。 アグロバクテリウムによる形質転換用バイナリーベクターには大きすぎると爆撃には不向きです。

II。カートリッジの準備

カートリッジの準備は、プラスミドDNAと続いて遺伝子銃のカートリッジホルダーにロードすることができる半インチ長い断片に切断されているプラ​​スチック製のチューブにそれらをロードするとコーティングの金粒子を含む。カートリッジの準....

Discussion

1. ：GFPまたは35S：：：GUS、初めてユーザーのために、我々は、35Sのような単一のプラスミド構成レポーターで、カートリッジの準備から観察するために、全体の手順を練習することをお勧めします。我々は、35Sを使用：：プラスミドGFPは、博士から入手。スティーブ山と小寧張^6（図1A、D）。 RioRad（猫165〜2244）で販売して遺伝子のショットコントロールのカートリッジは、植物には適していません。
2. BiFCは、2番目のポジティブコントロールは、それぞれ、C末端とYFPのN末端フラグメントに融合つの既知の相互作用のパートナーで構成される必要のある、必要がある。
3. BiFCの場合、それはいくつかのネガティブコントロールを含める必要があります：（1）蛋白質XがYFPのN末端フラグメントに加え、C末端断片をコードするベクターに融合された、（2）タンパク質YはC末端フラグメントに融合YFPプラスN末端断片をコードするベクターを、（3）ベクトルだけ。
4. 組織の損傷を減らすのに役立つショットを、発射時の拡散の画面は、ヘリオス遺伝子銃のバレルのベースに使用することができます。私たちの研究では、我々は拡散.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
イエロータマネギ	任意のサプライヤー
Helios Gene Gun	バイオ・ラッド
蛍光顕微鏡、GFPまたはYFP用の適切なフィルター付き	ツァイス、ニコン、オリンパス