Summary
O protocolo a seguir descreve o processo de dissecção pancreática para imagens fatia virtual, e posterior quantificação de todos os GFP-tagged células beta no pâncreas inteiro.
Abstract
Rastreamento alterações de populações de células específicas na saúde e na doença é um objetivo importante da pesquisa biomédica. O processo de proliferação de monitorização das células beta pancreáticas e crescimento das ilhotas é particularmente desafiador. Nós desenvolvemos um método para capturar a distribuição das células beta no pâncreas intacta de camundongos transgênicos com fluorescência marcadas beta-células com uma macro escrita para ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Após dissecção pancreática e limpeza de tecidos, o pâncreas inteiro é capturado como uma fatia virtual, após o que a GFP-tagged células-beta são examinados. A análise inclui a quantificação do total das células beta das ilhotas número área, e distribuição de tamanho com referência aos parâmetros e locais específicos para cada ilhota e para pequenos grupos de células-beta. Toda a distribuição das ilhotas podem ser plotados em três dimensões, e as informações a partir da distribuição do tamanho e da forma de cada ilhota permite uma comparação quantitativa e qualitativa das mudanças na área das células beta em geral num ápice.
Protocol
Parte 1: Preparação de Amostras
- Colocar um mouse sob um microscópio de dissecação, remover o pâncreas inteiro junto com o duodeno eo baço ainda ligado, e colocar os órgãos numa lâmina de vidro pré-pesados. Remove o duodeno, cortando suas tecido conjuntivo ao longo do lado onde é ligado ao pâncreas. Cortar e remover o baço e excesso de gordura sobre o pâncreas até que o pâncreas é completamente isolado no slide. (Gordura pancreática é distinguível por sua cor branca, como diferenciada da cor ligeiramente mais escura e curtidor de tecido pancreático.)
- Coloque uma lamela (tampa de vidro grande 50x75mm; padrão tampa de vidro 25x75mm) sobre o pâncreas para que ele seja totalmente coberto. Use um peso (por exemplo, um livro pesado) para achatar o pâncreas entre a lâmina ea sua capa. Dependendo do peso, achatando o pâncreas leva aproximadamente cinco minutos.
- Tire o peso. Se o pâncreas está bem achatado contra o slide, coloque-o em paraformaldeído 4% (PFA) a 4 ° C durante a noite. De manhã, retire as lamelas e bem expor o pâncreas inteiro para PFA durante o dia (08/06 horas). Se o órgão não está bem fixo, deixe-o permanecer no PFA mais, possivelmente durante a noite. Transferir as lâminas para o recipiente com 1% Triton x-100 em tampão fosfato salino (PBS) durante a noite. No dia seguinte, transferir os slides para o recipiente de sacarose saturada por 1-2 dias. Em seguida, transferir os slides a um recipiente de glicerol 100% até que o tecido é eliminado, o que permite a resolução ideal de sinais fluorescentes; limpeza de tecidos leva dias cerca de 1-3. (Os sinais fluorescentes podem persistir por semanas e até meses, mas de imagem deve ser realizada logo após o tecido é liberado para melhor resolução).
- Loja do pâncreas em uma área escura e fria, a fim de preservar o órgão e seus sinais fluorescentes.
Parte 2: Imagem e quantificar a área das células beta no pâncreas intacta
- Utilizando uma pinça ou luvas, pegue a deslizar para fora do recipiente com 100% de glicerol. Preparar os slides para imagens por limpando glicerol em excesso e exclusivamente a limpeza da parte de trás da tampa de vidro com etanol.
- Abra o software StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) e selecione a lente objetiva 2x para ratos imagem pancreata mais de três semanas em lâminas de vidro grande, ou a lente objetiva de 10x para os ratos imagem pancreata menos de três semanas pressionado entre duas lamínulas 25 milímetros. Visualize a imagem, colocando-o a viver de imagem (Image → Imagem Live). Selecionar um tempo de exposição que mostra claramente a GFP-tagged células-beta. (Underexposing a imagem exclui ilhotas menores e beta-células, enquanto a superexposição da imagem cria falsos sinais adicionais.)
- Clique em qualquer lugar na tela para estabelecer um ponto de referência e prossiga para desenhar um contorno ao redor do pâncreas inteiro. Iniciar o processo Slice Virtual (Imagem → Adquirir Slice Virtual). Determinar e selecionar o melhor plano focal ou seja, o avião com o maior número de ilhotas visível e concentrados e células-beta no eixo Z, deslocando o botão de foco. Uma vez escolhido, StereoInvestigator captura automaticamente a imagem exibida na tela. Com o estágio motorizado, o recurso Slice Virtual seqüencialmente capta cada painel óptico como uma imagem distinta dentro do contorno desenhada (Fig. 1A) e, em seguida, combina todos eles como uma imagem incorporada (Figura 1B). Slice imagem virtual usa uma configuração de epifluorescência ou seja, campo amplo filtros que permite que a câmera para capturar todos os sinais presentes em uma certa profundidade, incluindo aqueles que não perfeitamente em foco, de modo que o Slice finais Virtual é uma imagem bidimensional integrado que não é um máximo projeção a partir da reconstrução tridimensional do pâncreas inteiro. Tempo de varredura média Virtual Slice é de 30 min por amostra, mas pode demorar até uma hora por um pâncreas grande.
- Depois de salvar a imagem, começam a sua análise, abrindo a imagem com ImageJ. Quando a imagem termina de carregar e aparece na tela, abrir e executar a macro análise Virtual Slice ( Material Suplementar 1 ).
- Siga as instruções passo-a-passo fornecidas pela macro. Eliminar os artefatos indesejados criado por dispersão de luz com a "Magic Wand" e "Select Area" ferramentas. Verifique e subtrair de fundo desnecessária da imagem. Determine o raio da maior ilhota com a "Line" ferramenta para que o recurso de Bola Rolando que se seguiu pode efetivamente remover a luz autofluorescência e dispersos. Teste e selecionar a mais adequada "Threshold Low" para capturar os sinais fluorescentes de pequenas ilhas e grupos de células-beta (<3x10 M 4 2). Teste e selecionar a mais adequada "Threshold High" para capturar os sinais fluorescentes de ilhotas. Executar a quantificação da Slice Virtual, que irá medire produzir uma lista de área de ilhotas, perímetro, circularidade e diâmetro de Feret.
Figura 1A Virtual de análise de imagem Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto
Imagens de cada um dos painéis de óptica de um pâncreas do rato macho em 10 semanas tomadas no âmbito de um objectivo 2x. As imagens incluem toda a distribuição das ilhotas, mesmo pequenos grupos de células-beta (<10 células).
Figura 1B análise de imagem Virtual Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto
Uma fatia unificada virtual com o pâncreas dorsal à direita e do pâncreas ventral à esquerda. Barra de escala é de 5 mm.
Resultados representante
Preparação proficiente de um pâncreas para imagens Slice Virtual permitirá uma quantificação efectiva de todos os GFP-tagged células beta do pâncreas em um todo como uma imagem Slice Virtual com ilhotas claras e distintas. Imagem Slice sucesso Virtual do pâncreas todo in situ fornece os meios para examinar e quantificar as células-beta, não só a área da ilhota individual e total, mas também distribuição de tamanho de ilhotas, a análise regional, e padrões de crescimento também. Enquanto ImageJ mantém a capacidade para detectar todas as células beta-simultaneamente na análise de imagens Slice Virtual, ele também pode controlar o que as células-beta para quantificar, restringindo a análise a determinados tamanhos de ilhotas (por área ou o diâmetro), ou por localização. A análise padrão exclui artefatos por exemplo, os restos menores do que uma única célula beta-(<170 M 2) e registros da área, perímetro (a distância em torno de uma área), a circularidade (um grau de circularidade, onde 1.0 representa um círculo perfeito), Feret e diâmetro (a maior distância dentro de uma área) para cada ilhota detectado. Análise Slice Virtual é capaz de aumentar a fatia de imagens virtuais através do emprego de segmentação Watershed, que distingue e separa ilhotas sobreposição em ilhotas individuais de acordo com suas formas. A análise ainda produz uma série de imagens detalhadas, o que inclui máscaras das imagens em ambos baixa e alta intensidade (Fig. 1C), um esboço de todas as ilhotas presumido, que, individualmente, sejam numerados e listados em uma tabela de informação correspondente (Fig. . 1D), ea imagem Slice originais Virtual (Figura 1B). Nota que o viés potencial técnico na escolha de valores de limiar pode distorcer a quantificação dos ilhéus, incluindo luz gratuita em torno de grandes estruturas, ou reduzindo o número total de ilhotas, os sinais fracos, especialmente a partir de pequenas partículas.
Figura 1C Virtual de análise de imagem Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto
Uma máscara das partículas fluorescentes na fatia virtual. Códigos de cores: [1] azul: baixa intensidade de fluorescência; [2] verde: fluorescência intensidade intermediária, e [3] red: fluorescência de alta intensidade.
Figura de análise de imagens 1D Virtual Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto
Quantificação de ilhotas individuais / grupos de células-beta. Note que cada ilhéu (incluindo pequenos aglomerados de células-beta) é numerado, com as suas informações detalhadas em um gráfico correspondente. Quatro parâmetros foram tomadas para cada estrutura: (1) área (2); perímetro; (3) circularidade: um grau de circularidade, onde o número 1.0 representa um círculo perfeito, e (4) de diâmetro Feret: a maior distância dentro de uma área. Note que # exibe a resolução 706 análises com uma área de apenas algumas células-beta. Segmentação Watershed detecta grupos de ilhotas adjacentes, como o mostrado, e de forma adequada os distingue como ilhotas distintos (ilhotas 1554, 1555 e 1556).
Figura 1E Virtual de análise de imagem Fatia de toda a distribuição das células beta no pâncreas um adulto intacto
3-dimensional gráfico da análise fatia virtual, com eixos de área, perímetro e diâmetro de Feret. Cada ponto representa uma ilhota.
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Discussion
A análise de imagens Slice Virtual de ilhotas e células beta no pâncreas aglomerados intacto fornece uma visão em grande escala de toda a distribuição das ilhotas. Desenvolvimentos e mudanças na distribuição total de ilhotas ao longo do tempo pode assim ser estudados e comparados. Um exemplo é demonstrado em nossa análise de formação de ilhotas pancreáticas (1). Uma análise abrangente da pancreata ratos neonatal em momentos diferentes (P1-P21) demonstrou que ilhotas são formadas por fissão. Enquanto a proliferação de células beta se encaixa com uma função densidade de probabilidade lognormal em camundongos a partir de P1-P10, P12 ilhota distribuição de diante desvia para a esquerda fora do padrão lognormal, sugerindo um processo de fissão. Uma análise similar foi realizada em desenvolvimento insulinoma progressivo em camundongos, que montado uma função lognormal com os parâmetros da posição de pico e eixo-x, escala e uma distribuição de lei de potência (2): 
P (x) y = ax. Os dados são efetivamente apresentados em gráficos tridimensionais da área, perímetro e diâmetro Feret (Fig. 1E). Para o nosso estudo, os camundongos transgênicos, em que células beta do pâncreas foram geneticamente marcadas com proteína fluorescente verde (GFP, 3, 4) sob o controle da insulina mouse eu promotor (MIP), foram usados. MIP-GFP também podem ser cruzados com outras específicas camundongos transgênicos em estudos futuros.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O estudo é apoiado por EUA Public Health Service Grant DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 para a Universidade de Chicago Diabetes Centro de Pesquisa e Treinamento (Core modelos animais), e um presente da Fundação Família Kovler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
