다른 유전자에 의해 보상이있다면 유전자 기능이 손실의 기능 실험에 드러나지 수 있습니다. zebrafish 모델은 생활 배아에서 이러한 기능 중복을 나타내기 위해 상대적으로 높은 처리량 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
embryogenesis 동안 유전자 기능은 일반적으로 마우스를 대상으로 돌연변이 유발 (녹아웃)에 의해 예를 들어, 손실의 기능을 실험에 의해 정의됩니다. zebrafish 모델에서 효과적인 반대로 유전자 기술은 유전자 특정 안티 센스 morpholinos의 microinjection을 사용하여 개발되었습니다. Morpholinos은 embryogenesis (최저)에 며칠 동안 억제 번역 또는 splicing에 의해 transiently 특정 기본 - 페어링 및 차단 유전자 기능을 통해 mRNA를 타겟팅할 수 있습니다. 그러나, 마우스 또는 zebrafish과 같은 척추 동물에서 일부 유전자의 기능이 손실에 대한 보상 다른 유전자의 존재로 인해 이러한 방식으로 드러나지 수 있습니다. 이 같은 개발 조직의 공동 표현 자매 유전자를 포함한 유전자 가족에 특히 사실이다. zebrafish에서 기능성 보상은 morpholinos의 공동 주입하여 상대적으로 높은 처리량 방식으로 테스트할 수있는 동시에 유전자의 대상 최저. 마찬가지로, morpholinos를 사용하여 임의의 두 유전자 사이에 유전자 상호 작용이 하위 임계값 수준에서 함께 두 유전자의 분해에 의해 입증하실 수 있습니다. 예를 들어, morpholinos는 어느 개인의 분해가 표현형을 생성 이러한 titrated 수 있습니다. 이러한 조건에서 두 morpholinos의 공동 주사가 표현형 원인 경우, 유전자 상호 작용이 나타납니다. 여기 두 관련 가타의 전사 요소의 컨텍스트에서 기능 중복을 표시하는 방법을 보여줍니다. 가타 요인은 심장 progenitors의 사양에 필수적인,하지만 이것은 Gata5와 Gata6 모두의 손실에 의해 드러났습니다. 우리는 microinjection 실험을 수행 morpholinos를 확인하고, cardiogenesis에 대한 보상 표현형을 평가하는 방법을 보여줍니다.
프로토콜
여기서 우리의 목표는 cardiomyocyte progenitors의 사양 두 가지 전사 인자의 기능 중복을 테스트하는 것입니다. 요소는 두 관련 유전자 gata5 및 gata6로 인코딩하고 우리는 그들의 상대적인 기능 하나를 이해하기 위해 zebrafish 모델을 사용하고 있습니다. 우리의 전략은 morpholinos 2를 사용 유전자 기능을 차단하는 것입니다. 우리는 하나 또는 수정된 달걀에 다른 유전자에 대한 morpholinos를 삽입하고, 두 morpholinos와 동시에 주입 계란에서 파생 배아로 배아 표현형을 비교합니다. phenotypes의 평가를 단순화하기 위해, 우리는 cardiomyocytes에서 GFP를 표현 transgene 들고 생선에서 나온 계란을 사용합니다.
1 단계. microinjection 준비.
물고기의) 설정 번식 쌍
사전 주사에 저녁은 하나의 남성과 여성의 단일 성인 물고기 (세 3~18개월)은 다음 날 아침까지 구분선으로 구분 개종 탱크에 쌍에 배치됩니다. 우리는 일반적으로 물고기의 10~20쌍을 설정하고, 이러한 생산력을 유지하기 위....
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토론
실험이 여기에 설명된에서는, 우리는 두 morpholinos 혼자 phenotypes의 독특한 범위를 생성하는 각각을 결합하고, 그들이 함께 공동으로 주입되었다 완전히 다른 표현형을 발견했습니다. 물론, 우리는 처음부터이 실험을 수행하는 명분이 필요했습니다. 우리는 두 유전자이 경우 심장 사양에, 이전 기능에 대한 서로를 보상 수도 의심. 유전자가 매우 관련이 있습니다 (같은 DNA 시퀀스에 바인딩 수)과 5 embryogenesis 동안 패턴을 중복으로 표현되기 때문입니다. 또한, Drosophila의 유전자 실험은 가타의 전사 요소 심장 사양 6 필요합니다 지적했다.
그러나이 전략은 유전자 상호 작용에 대한 더 일반적으로 기능 중복 또는 테스트에 사용될 수있는 다른 상황이있다. 첫째, 하나 또는 둘 모두 유전자의 분해는 명백한 표현형를 생성하지 않을 수도 있습니다. 이 경우, 각 유전자에 대한 정의 임계값 수준가 없으.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프레 젠 테이션을 준비하는 그들의 도움 에반스 실험실 구성원 감사합니다. 여기에 사용되는 morpholinos는 원래 박사 오드리 Holtzinger에 의해 확인되었다. TE는 국립 보건원 (HL064282 및 HL056182)에서 기금에 의해 지원됩니다. 동물 실험은 웨일 코넬 메디컬 칼리지의 동물 관리 및 사용위원회 연구소에 의해 명시된 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 물고기 사육 수조 및 격벽 | Aquatic Habitats | ||
| 물고기 뜰채 | Aquatic Habitats | ||
| 시스템 용수 | dH2O 리터당 60mg Instant Ocean” | ||
| 100mm 페트리 접시 | BD Biosciences | 351029 | |
| 마이크로피펫 니들 풀러 | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" 유리 모세관 | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 면도날 | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| 마이크로 그라인더 | Narishige International | EG-4 | |
| 눈금형 현미경 접안렌즈 | Premiere | MF-02 | |
| 마이크로미터 | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| 초고순도 아가로스 | Invitrogen | 15510-027 | |
| 스파출라 | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 저울 | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| 일회용 칭량접시 | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| 일반 전자레인지 | GE Healthcare | ||
| 삼각 플라스크 | Corning | 4980 | |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-552 | |
| 메스실린더 | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| 자동 피펫맨 | BrandTech | 2026333 | |
| 70% 에탄올 세척액 | Tarr | 801VWR | |
| N2 탱크 | Tech Air | ||
| 마이크로인젝터 | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 마이크로매니퓰레이터 | Micro Instruments | LTD | |
| 해부 현미경 | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| 파라필름 | American National Can | PM-992 | |
| 미네랄 오일 | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 킴와이프스 | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 스플라이스 사이트 모르폴리노 | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG 블로커 | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 롱 이소폼 ATG 블로커 | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| 일회용 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| 메틸셀룰로스 | ICN Biomedicals | 155495 | |
| 히팅 블록 | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| 정밀 핀셋 | Dumont | Size 55 | |
| 오목 슬라이드 글라스 | VWR international | 48339-009 |
참고문헌
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6,....
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