Summary
Ici, nous décrivons un non-invasive à deux photons approche microscopique (2P) pour l'étude des leucocytes homing dans le coussinet plantaire de la souris. Nous discutons des aspects techniques de notre préparation imagerie des tissus et de marcher le lecteur à travers une expérience typique de la configuration initiale à la collecte de l'exécution et des données.
Abstract
À deux photons (2P) est une technique de microscopie à haute résolution d'imagerie qui a été largement adaptée par les biologistes. La valeur de la microscopie 2P est qu'il fournit de riches informations sur les comportements spatio-temporelle des cellules dans les tissus intacts et dans des souris vivantes. Le recrutement des leucocytes jouent un rôle important dans la défense de l'hôte contre l'infection et quand incontrôlée, peut contribuer à des maladies inflammatoires et autoimmunes. Etudier le recrutement des leucocytes in vivo est un défi technique, car les cellules se déplacent rapidement dans les vaisseaux situés en profondeur dans les tissus diffusion de la lumière. À ce jour, la plupart des études d'imagerie intravitale nécessitent une préparation chirurgicale pour exposer les vaisseaux sanguins et des tissus. Pour éviter les dommages tissulaires et l'inflammation induite par la chirurgie elle-même, ici, nous décrivons une approche non invasive d'imagerie à cellule unique qui peut être utilisée pour étudier le trafic des leucocytes dans le coussinet plantaire de souris et des phalanges. Nous discutons des aspects techniques de notre préparation imagerie 2P et marcher le lecteur à travers une expérience typique de la configuration initiale à la collecte de l'exécution et des données.
Protocol
1. La préparation des animaux:
Ce protocole utilise adulte femelle adulte LysM-eGFP souris, dans lequel les neutrophiles et les macrophages sont marqués par fluorescence par l'expression de eGFP 1.
- Étiquetage des vaisseaux sanguins:
Pour visualiser les vaisseaux sanguins, 15μl de points quantiques non-ciblées (655nm) sont dilués dans 100 ul de PBS et injecté par voie intraveineuse chez la souris 10-30 min avant l'imagerie. - Anesthésie:
- Placez la souris dans la chambre de l'induction de l'anesthésie par inhalation système de vétérinaires (Noble Service médical, Inc).
- Réglez le vaporisateur à 3-4% isoflurane et le transporteur 100% du débit d'oxygène gazeux taux à ~ 1 L / min. Afin d'éviter un surdosage accidentel d'anesthésie, de surveiller étroitement l'animal jusqu'à ce que le réflexe de pieds à l'arrière de pincement est perdu.
- L'anesthésie est maintenue à 1,5 ~ 2% isoflurane et peaufiné lors de l'imagerie afin de minimiser les artefacts de respiration si nécessaire. Le rythme respiratoire de la souris est surveillée attentivement tout au long de la séance d'imagerie afin d'assurer un avion adéquat d'anesthésie.
- Puralube une pommade vétérinaire est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement.
- La souris est placée sur un 36 ° C régulée coussin chauffant (Braintree scientifique) pendant les injections et l'imagerie et à prévenir l'hypothermie.
- Pour prévenir la déshydratation, la souris est donné 100 ul de PBS SC toutes les 1-2 heures.
- Offrir un stimulus inflammatoire pour induire le recrutement des leucocytes:
- Placez la souris sur la scène la chirurgie et le coussinet plantaire tige avec de l'éthanol à 70%.
- Plier l'aiguille d'une seringue à insuline ~ 90 degrés près de la conique pour faciliter l'injection et d'améliorer la précision de la profondeur de livraison.
- Charger la seringue avec 0,5 pg de E.coli bioparticules dilué dans 1 microlitre PBS. Cela peut être fait dans le couvercle d'un tube de centrifugeuse pour rendre plus facile à charger les gouttelettes.
- Tenir le pied avec une pince courbée et insérer l'aiguille doucement à travers la peau avec le biseau vers le haut jusqu'à ce qu'il soit juste en dessous de la peau.
- Injecter lentement et maintenir en place pendant 5 secondes pour éviter tout retour rincer.
2. Configuration scénique d'imagerie:
La plate-forme d'imagerie se compose d'une plaque d'aluminium avec un trou circulaire coupé par le centre. Un couvercle en verre grande est collée sur le bas de la plaque et un joint torique en caoutchouc est collé sur le dessus pour créer une chambre étanche renfoncés pour la patte arrière. La plaque d'aluminium est chauffé à 36 ° C au moyen de deux éléments de chauffage fixé au sommet de la plaque.
- Placez la souris sur la scène d'imagerie pré-chauffée et maintenir la température centrale du corps de la souris en utilisant le pavé de 36 ° C le réchauffement.
- Fixez la patte de la lamelle de la chambre de l'imagerie avec un mince film de colle.
- Laver la patte à deux reprises pour enlever tous les débris flottants de colle, puis remplir la chambre avec du PBS frais (préchauffé à 36 ° C).
Les souris peuvent être imagées pour un maximum de 4 heures sans comprenant la viabilité de l'animal. Le pied peut être doucement libérée avec une petite quantité d'acétone et de souris repris pour les études d'imagerie longitudinales. Toutefois, dans ce cas, nous recommandons la période d'imagerie à <2 heures et 24-48 heures d'attente entre les séances afin de minimiser le risque de surdose d'anesthésie ou de déshydratation.
3. Acquisition d'imagerie
Le microscope à deux photons (microscope 2P) utilisé dans ce protocole est un sur-mesure à double laser, vidéo-système de taux comprenant un microscope droit. Le système est équipé de deux Ti: Sapphire lasers, quatre de front Bi-alcali PMT pour les acquisitions simultanées canal 3 et 4 et d'un objectif 20x immersion dans l'eau (l'Olympe, 20x/0.95 NA).
- Tune le Caméléon XR Ti: saphir laser (Coherent Inc) à 890-900nm.
- Utilisez 480nm et 560nm miroirs dichroïques (SemRoc) pour séparer trois canaux: le bleu (<480 nm, la deuxième génération d'harmoniques du signal), vert (480-560nm, LysM-eGFP neutrophiles positifs) et rouge (> 560 nm, quantum dot vaisseaux sanguins étiquetés ). Sinon, le filtre 560nm peut être remplacé par un filtre 570nm pour distinguer E. bioparticules coli (576nm bioparticules apparaîtra en orange) à partir des points quantiques 655nm (apparaîtra rouge profond).
- Abaisser avec précaution l'objectif dans le PBS et se concentrer sur un navire de l'orteil.
- Avec la vitesse de fonctionnement d'acquisition d'images à la vidéo-taux (30f/sec) et en utilisant le signal de second harmonique émanant de collagène des tissus comme un repère, rapidement enquête sur les tissus (à la vitesse d'acquisition vidéo-taux) pour localiser un vaisseau sanguin d'intérêt (un avec les visibles lysM-eGFP neutrophiles).
- Réglez le gain sur la PMT pour optimiser la séparation des couleurs et minimiser la quantité de laser requise pour obtenir un signal suffisamment sur fond (soitAttention à ne pas saturer l'image!).
- Une fois que la région centre d'intérêt se situe, commencent imagerie time-lapse. Time-lapse imagerie peut être effectuée avec deux différentes résolutions temporelles. Pour rouler imagerie cellulaire et de l'adhérence et en temps réel dans les vaisseaux sanguins, nous acquérons 30f/sec à un simple plan z. Pour documenter l'extravasation des cellules et la migration dans le parenchyme nous effectuons 3D imagerie time-lapse. Un protocole d'acquisition typiques consistera en moyenne 15 images pour chaque étape et Z-acquisition 21 2.5μm séquentielle z-étapes pour un volume de 200 à 225 50 microns, à intervalles de 30 sec.
- Une fois les fichiers de données sont stockés sur le serveur de laboratoire, des logiciels ou des Imaris Volocity peut être utilisé pour effectuer le rendu multi-dimensionnelle et de la cellule de suivi 2, 3.
4. Les résultats représentatifs
1.Real-temps (30f/sec) imaginant des neutrophiles rouler le long des vaisseaux à 200x. Laps de temps d'imagerie montre des neutrophiles, en vert, rouler le long de l'endothélium des vaisseaux sanguins environ 10 minutes après l'infection par la bactérie Listeria monocytogenes, représentée en rouge. Les fibres de collagène dans le tissu conjonctif apparaissent en bleu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir la vidéo.
2.Les-lapse imagerie 3D de la dynamique de recrutement des neutrophiles à 200x. Typiques recrutement des neutrophiles de la circulation et la migration à travers les tissus enflammés est montré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir la vidéo.
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Discussion
Dans ce protocole vidéo nous montrent les procédures d'imagerie non-invasive 2P du recrutement des leucocytes en réponse à l'inflammation.
Le coussinet plantaire est un site classique pour l'étude de l'inflammation physiologiques telles que la maladie d'allergie, d'infection et auto-immunes 4-7. 2P imagerie fournit une image détaillée des étapes distinctes dans les voies de trafic de leucocytes, de laminage et d'adhérence dans les vaisseaux sanguins pour chimiotactisme vers les sites des fonctions effectrices. Nous avons constaté que le recrutement des leucocytes varie en réponse à différents types de stimuli inflammatoires. La dose de relance devraient être choisis avec soin et chaque tentative de récapituler une insulte physiologiques. Si la dose est trop élevée ou livré à un site non-physiologique, la stimulation pourrait submerger l'hôte ou conduire à des artefacts expérimentaux et produire des phénomènes anormaux. Nous recommandons des doses titrées de stimuli pour des expériences pilotes jumelé à un contrôle approprié et en utilisant une aiguille tordue pour augmenter la précision à la fois du volume livré et la profondeur de l'injection. Il est également crucial que le site d'injection peuvent être facilement localisées, en particulier pour des expériences d'imagerie de série. Ceci peut être accompli par l'injection à un endroit précis (par exemple, le deuxième chiffre le troisième orteil de la patte arrière droite) ou par le tatouage de la peau et l'injection de proximité.
2P imagerie fournit une occasion unique de visualiser le trafic des leucocytes et des fonctions effectrices in vivo. La majorité de l'imagerie intravitale des approches utilisées pour étudier le recrutement des leucocytes nécessitent une intervention chirurgicale pour exposer les tissus et les vaisseaux sanguins en 8-10 souris anesthésiées. La chirurgie elle-même induit une inflammation qui va influer sur le comportement des leucocytes. Toutefois, 2P imagerie permet leucocytes d'être étudié de façon non invasive et à un seul cellule de résolution au plus profond de l'environnement tissulaire 3D natif. En outre, depuis la procédure d'imagerie lui-même ne pas nuire à la souris, il est un excellent choix pour effectuer des études longitudinales pour les modèles de cancer et d'arthrite. 2P imagerie a le potentiel de fournir et de vue sans précédent sur un processus pathologique de l'initiation et la progression de la maladie de la résolution, le tout dans une réserve d'animaux individuels. Cette approche est un outil précieux pour obtenir un aperçu des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent l'immunité cellulaire à l'infection et comment ces mêmes réponses, si elle est mal réglementée, peut conduire à des maladies inflammatoires et auto-immunes. En fin de compte, une image détaillée du comportement des leucocytes in vivo sera une aide dans le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies inflammatoires et infectieuses.
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Disclosures
Toutes les expériences ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité des études animales de l'Université Washington à St Louis.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH R01-3155-53502 et de l'Université de Washington-Pfizer accord de recherche biomédicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
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