Summary
La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.
Abstract
DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente letali e genotossici, che possono derivare sia da processi endogeni (fisiologici o patologici) o da fattori esogeni, in particolare le radiazioni ionizzanti e composti radiomimetici. Fosforilazione della variante dell'istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX, è una risposta precoce al DNA a doppio filamento
Protocol
Tessuti
- Tessuto polmonare, incorporati in stampi in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto 4583, è stato sezionato (5 micron) utilizzando un criostato Leica CM 1950, montato su poli-L-lisina diapositive.
I campioni congelati sono stati ottenuti dal dottor Simon Royce a bambini di Murdoch Research Institute. Tessuto polmonare è stato ottenuto da Balb non trattata / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree che mostra molte delle caratteristiche patologiche di asma umano 6. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal Comitato Etico della Animal Research Institute Children Murdoch che aderisce al Codice di Pratica australiano per la cura e l'uso di animali da laboratorio per scopi scientifici.
- Le sezioni sono stati lasciati asciugare all'aria a temperatura ambiente per 1 ora.
Immunofluorescenza
- Le sezioni sono stati fissati con il 2% (w / v) paraformaldeide in tampone fosfato (PBS) per 20 minuti.
- Sezioni sono state equilibrata con due lavaggi in PBS per 15 minuti ciascuno.
- Le sezioni sono state trattate con etanolo al 70% (refrigerate a -20 ° C) per 20 minuti, seguita da tre lavaggi in PBS per 10 minuti ciascuno.
A questo punto i vetrini possono essere conservati in contenitori sigillati a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
- Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna e quindi bloccato con 100μL preparati al momento in PBS contenente 8% di BSA in PBS contenente 0,5% Tween-20 e dello 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) per 1 ora a temperatura ambiente .
Tutte le incubazioni sono state eseguite in una vasca colorazione umidificato. - Sezioni sono state lavate con PBS-TT per 5 minuti e un perimetro idrofobico è stato segnato in tutto il tessuto con una penna Pap.
- Tampone in eccesso è stata una soffiata e 100μl di primario policlonale di coniglio anti-γH2AX anticorpi (diluito 1:500 in 1% BSA in PBS, Millipore), è stata aggiunta ad ogni sezione per un 2 ore di incubazione a temperatura ambiente.
Incubazione con anticorpo primario può essere eseguito durante la notte a 4 ° C.
Per ulteriori prove, che rappresentano focolai γH2AX DSB, un anticorpo primario riconoscere una proteina riparazione DSB può anche essere usato. Per esempio, co-localizzazione di γH2AX e fosfo-ATM è una combinazione di uso comune. - Le sezioni sono state lavate due volte in PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubato con 100μl di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio diluito 1:500 in 1% BSA, Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente al buio . (Anticorpo diluito è stato tenuto al buio tutta la procedura).
- Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubate con 0.5mg/mL RNase A per 30 minuti a 37 ° C.
- Nucleare di contrasto e di montaggio è stato eseguito con mezzo Vectashield contenenti ioduro di propidio.
- I vetrini sono stati sigillati con smalto e conservato durante la notte a 4 ° C al buio prima dell'analisi.
Microscopia / Analisi
- A Meta Zeiss LSM510 microscopio confocale è stato utilizzato per acquisire immagini utilizzando la GFP standard (per γH2AX - Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio) e PI (543 nm).
Le immagini sono state acquisite in una serie Z tracciato con dimensione del passo di 0,5 micron. Durante l'analisi, i piani individuali sono stati deconvoluted e impilati per produrre una immagine proiettata al massimo per minimizzare la sovrapposizione dei focolai.
Il metodo di creazione di una immagine proiettata al massimo prima di un numero di particelle deve essere utilizzato solo in circostanze in cui viene utilizzata una sezione sottile (ad esempio 5 micron) e dove la colorazione di fondo è insignificante. Dove più spesso le sezioni con un significativo background deve essere analizzato, una analisi più complesse come Contatore oggetto 3D come descritto da Bolte e Cordelieres (2006) deve essere usato 7.
- Metamorph (Molecular Devices, USA) è stato utilizzato per creare fusi (rosso e verde) immagini per quantificare il numero di focolai.
Anche se Metamorph può essere utilizzato per quantificare i numeri focolai, derivante dall'uso di sezioni di tessuto focolai vengono conteggiati manualmente (ad occhio) per una maggiore precisione.
Specifici tipi cellulari di interesse possono essere selezionati per la quantificazione, per esempio le cellule epiteliali del polmone. Ciò può essere fatto sulla base di istologia e con riferimento al ematossilina e eosina sezioni colorate seriale.
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Discussion
Ai fini di questa dimostrazione abbiamo usato tessuto polmonare del mouse non trattati da Balb / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree. Abbiamo quantificato differenze nel numero di focolai per cella con medie leggermente più alto osservato nei polmoni danneggiati rispetto a sezioni non trattati. In particolare, la quantificazione indicato per 6,5 focolai / cellulare e del 9,4 per focolai / cella (conteggio manuale di 20 cellule per sezione), nei tessuti non trattati e cronica malattia del tessuto allergiche delle vie respiratorie, rispettivamente. Tuttavia, l'uso di un DSB-agente di induzione, per esempio naftalene, che è conosciuto per indurre DSB nel modello polmone mouse, darebbe i numeri focolai superiore. In effetti, questo protocollo è più adatto per lo studio degli effetti delle radiazioni ionizzanti nei tessuti, i risultati più sorprendenti, in termini di numeri γH2AX focolai e la risoluzione si ottengono quando si utilizza radiazioni ionizzanti. E 'ben noto che in seguito all'esposizione ai raggi X, γH2AX forma foci rapidamente e numeri focolai raggiungono un massimo tra 30-60 minuti 2. Pertanto, 1 punti di tempo ora (post-irradiazione) sono ideali per la valutazione iniziale formazione DSB e tempi più lunghi (in genere fino a 48 ore) può essere utilizzato per monitorare la riparazione del DNA.
Nel complesso, la quantificazione delle γH2AX nei tessuti è utile per monitorare la formazione di DSB e riparazione. Oltre alla sua utilità nel contesto di radiazioni ionizzanti, il metodo può essere applicato alla valutazione dell'efficacia del DSB composti che causano in vari tessuti, per esempio il comune used antracicline antitumorali come la doxorubicina sono noti per causare DSBs, e potenzialmente di monitorare varie patologie che sono caratterizzati da specie reattive di ossigeno-mediata DSB. È importante sottolineare che questo protocollo è adatto per i tessuti mouse.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro. MMT è grata per l'assistenza di esperti e la consulenza del Dr. Olga Sedelnikova dal National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
