Summary
γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.
Abstract
DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)은 내생 (생리적 또는 병리) 프로세스 또는 외인성 요인, 특히 이온화 방사선 및 radiomimetic 화합물을 통해 발생할 수 특히 치명와 genotoxic 병변입니다. 세린 - 139 잔여물에서 H2A 히스톤 변형, H2AX,의 인산화는 높은 보존 C - 터미널 SQEY의 모티브에 γH2AX을 형성, DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 초기 응답입니다
Protocol
조직
- 최적의 절삭 온도 (-10 월) 4,583 화합물의 금형에 포함된 폐 조직, CM Leica 1,950 그라 이오 스탯을 사용하여 (5 μm의) sectioned되었으며 폴리 - L - 라이신 슬라이드에 장착.
냉동 샘플은 머독 아동 연구소에서 박사 사이먼 로이스 얻은되었습니다. 폐 조직은 치료 Balb / C 마우스에서 인간 천식 6 병적인 많은 기능을 보여줍니다 만성 알레르기기도 질환의 마우스 모델에서 얻은 것입니다. 동물 실험은 과학적 목적으로 실험 동물의 보호 및 사용에 대한 실천의 호주 강령을 준수 머독 아동 연구소의 동물 윤리위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
- 제는 1 시간 동안 실온에서 건조 공기를 허용되었다.
Immunofluorescence 염색법
- 제 2 % (W / V) 인산의 paraformaldehyde 20 분 동안 호수 (PBS)를 버퍼로 고정되었습니다.
- 섹션 15 분 각각에 대해 PBS에 두 세척과 equilibrated되었습니다.
- 제 10 분마다 PBS에 세 세척 다음 20 분 70 % 에탄올 (-20 ° C로 냉각)과 치료를했다.
이 시점에서 슬라이드는 최대 2 주 4 ° C에서 밀폐 용기에 저장할 수 있습니다.
- 제 10 분마다 PBS로 세 번 씻어 후 갓 PBS는 0.5 % 트윈 - 20와 0.1 %를 포함하는 8 %의 BSA가 포함된 PBS에서 준비 100μL로 차단되었습니다 트리톤 실온에서 1 시간을위한 X - 100 (PBS - TT) .
모든 incubations은 humidified 얼룩 트러프에서 수행되었다. - 제 5 분간 PBS - TT와 세탁되었고 소수성 둘레는 자궁 펜으로 조직 주위에 표시되었다.
- 초과 버퍼 밀고되었으며 기본 토끼 polyclonal 방지 γH2AX 항체 (PBS에 1 % BSA에 1:500 희석, Millipore)의 100μl은 상온에서 2 시간 보육에 대한 각 섹션에 추가되었습니다.
기본 항체와 배양 4에서 하룻밤을 수행할 수 있습니다 ° C.
자세한 증거를 들어, 그 γH2AX foci가 DSBs을 대표, DSB 복구 단백질을 인식 차 항체도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, γH2AX 및 phospho - ATM의 공동 지방화는 일반적으로 사용되는 조합입니다. - 어둠 속에서 실온에서 1 시간, 섹션은 5 분마다 PBS - TT 두 번 씻어 및 보조 항체의 100μl (Invitrogen 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 토끼 IgG가 1퍼센트 BSA에서 1:500 희석)와 incubated되었습니다 . (희석 항체가 절차를 통해 어둠에 보관했다).
- 제 5 분마다 PBS - TT와 세 번 씻어 37시 30 분에 대한 0.5mg/mL RNAse ° C.와 incubated되었습니다
- counterstaining 및 장착 원자력은 propidium 요오드화물을 포함하는 제품 Vectashield 매체로 수행되었다.
- 슬라이드는 매니큐어로 밀봉하고 ° C 어둠 속에서 분석하기 전에 4 박 저장되었습니다.
현미경 / 분석
- (- 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 토끼 IgG γH2AX)와 PI (543 NM) 레이저 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 현미경은 표준 GFP를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용되었다.
이미지는 0.5 μm의의 스텝 크기와 Z - 시리즈 패턴에 인수했다. 분석하는 동안, 개인 비행기는 deconvoluted 및 foci의 중복을 최소화하기 위해 최대 예상 이미지를 생산 쌓인했다.
이전 입자 개수에 최대 예상 이미지를 만드는 방법은 얇은 섹션 (예 : 5μm)이 사용되며 배경 얼룩이 하찮은 것은 어디 있죠 상황에서만 사용해야합니다. 큰 배경 두꺼운 부분을 분석해야합니다 어디로 볼트와 Cordelieres (2006)에 의해 설명 같은 3D 개체 카운터와 같은 좀 더 복잡한 분석은 7 사용해야합니다.
- Metamorph (분자 디바이스, 미국)는 foci의 번호를 quantitate 합병 (빨간색과 초록색) 이미지를 만드는 데 사용되었다.
Metamorph는 조직 섹션 foci가 높은 정확도 (눈으로) 수동으로 계산됩니다를 사용하여 일반적으로 때 foci 번호를 quantitate하는 데 사용할 수 있지만.
관심의 특정 세포 유형의 인스턴스 폐 상피 세포, quantitation에 대해 선택할 수 있습니다. 이것은 조직학 및 haematoxylin 및 eosin 스테인드 시리얼 섹션을 참조로 기반을 할 수 있습니다.
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Discussion
우리가 치료 Balb / C 마우스에서와 만성 알레르기기도 질환의 마우스 모델에서 마우스 폐 조직을 사용하는이 예제의 목적을 위해. 우리는 치료 부분에 비해 손상된 폐에서 관찰 약간 높은 평균과 셀 당 foci의 숫자의 차이를 quantitated. 특히, quantitation는 각각의 치료 조직 및 만성 알레르기기도 질환의 조직에서 / 셀 당 6.5 foci 및 9.4 foci 당 / 셀 (항목 당 20의 세포 수동으로 계산) 지적했다. 그러나, 마우스 폐 모델 DSBs을 유발하는 것으로 알려져 예 : 나프탈렌에 대한 DSB - 유도 요원의 사용, 높은 foci 번호를 얻을 것입니다. 사실,이 프로토콜은 대부분의 조직에 이온화 방사선의 영향의 조사에 적합합니다, γH2AX foci 번호와 해상도 측면에서보다 눈에 띄는 결과는 이온화 방사선을 사용하는 경우 얻을 수 있습니다. 이곳은 X - 레이에 다음과 같은 노출이 빠르게 γH2AX foci 양식 및 foci 번호가 30-60분 2 사이의 최대에 도달 것이 알려져 있습니다. 따라서 1 시간 시간 포인트 (사후 조사)은 초기 DSB 형성과 DNA 복구를 모니터링하는 데 사용할 수있는 더 이상 시간 (일반적으로 최대 48 시간) 평가에 이상적입니다.
전체 조직에 γH2AX의 quantitation는 DSB 형성 및 수리를 모니터링하는 데 유용합니다. 이외 이온화 방사선의 맥락에서 그 유틸리티에서, 방법은 DSB가 - 유도하는 다양한 조직에서 화합물, 예를 들어 같은 doxorubicin과 같이 일반적으로 사용되는 anticancer anthracyclines가 DSBs를 일으키는 것으로 알려져 있습니다의 효능 평가에 적용할 수 있으며, 잠재적 모니터 반응 산소 종 - 중재 DSBs에 의해 특징 다양한 pathologies. 중요한 것은,이 프로토콜은 다른 마우스 조직에 적합합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다. MMT는 국립 보건원에서 박사 올가 Sedelnikova에서 전문가 지원 및 조언 감사합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
