Summary
Die IP-FCM-Methode vorgestellt, die eine sensible, robust, biochemische Beurteilung der nativen Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Stichproben.
Abstract
Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie (IP-FCM) erkannt ist eine effiziente Methode zur Detektion und Quantifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Das Grundprinzip erstreckt, dass der Sandwich-ELISA, wobei die erfassten primären Analyten zusammen mit anderen Molekülen physisch innerhalb Multiproteinkomplexen verbunden erkannt werden. Das Verfahren beinhaltet die kovalente Kopplung von Polystyrol-Latex-Mikroperlen mit immunoprecipitating monoklonale Antikörper (mAb) spezifisch für ein Protein von Interesse, Inkubation diese Perlen mit Zelllysaten, Sondieren erfasst Protein-Komplexen mit Fluorochrom-konjugierten Sonden und Analyse bead-assoziierten Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie. IP-FCM ist extrem empfindlich, ermöglicht die Analyse der Proteine in ihrer nativen (nicht-denaturierten) Zustand, und ist zugänglich entweder semi-quantitative oder quantitative Analyse. Als weitere Vorteile, erfordert IP-FCM keine Gentechnik oder spezielle Ausrüstung, außer einem Durchflusszytometer, und es kann ohne weiteres für High-Throughput-Anwendungen angepasst werden.
Protocol
Hochempfindliche Detektion und quantitative Analyse von nativem Protein-Protein-Interaktionen und Multiproteinkomplexen mittels Durchflusszytometrie: ** Dieses Video-Protokoll basiert auf einem zugehörigen Publikation 1. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. Science STKE 2007 (389): pl2, 5. Juni 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Bitte klicken Sie hier, um diese Publikation zu sehen .
Vor Beginn der Vorbereitung der folgenden wässrigen Stammlösungen:
| MES Coupling Buffer: | Lagerung bei 25 ° C |
| MES, pH 6,0 | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| Abschrecken / Blocking / Storage (QBS) Buffer: | Lagerung bei 4 ° C |
| BSA | 1% |
| Natriumazid | 0,02% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
| FCM-Puffer: | Lagerung bei 4 ° C |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| Natriumazid | 0,02% |
| FBS | 5% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
Bereiten Sie unmittelbar vor dem Gebrauch:
| EDAC-MES: | 50 mg / mL EDAC Pulver in MES Kupplungspuffer |
| Digitonin-Lösung (2% w / v): | Lösen Sie Digitonin Pulver in dH 2 O durch Erhitzen auf 95 ° C für 5min anschließendes Abkühlen auf Eis |
| Lysis Buffer: | |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mm |
| Digitonin-Lösung | 1% |
| Protease-Inhibitoren | 1x |
| Keep on ice |
1. Kopplung von mAb an Beads
- Bestimmen Sie die Konzentration der Perlen aus den gekauften Aktien durch Verdünnung in PBS und das Zählen mit einem Hämacytometer. Beginnen Sie mit einer 1:10000 Verdünnung von Perlen zum Zählen.
- Pipette 18 x 10 6 Perlen in einer 1,5-ml-Reaktionsgefäß.
- Waschen Sie die Kugeln von 2 bis 3 mal in 0,5 bis 1,0 mL MES-Kupplung Puffer, Zentrifugieren bei 20.000 g für 3 Minuten bei 25 ° C nach jeder Wäsche.
- Resuspendieren der Beads in 50 ul MES Coupling Buffer.
- Aktivieren Sie die Carboxylgruppen auf die Perlen durch Zugabe von 20 ul der frisch zubereiteten EDAC-MES.
- Vorsichtig mischen und 15 min bei 25 ° C von Hand-und Abpipettieren.
- Waschen Sie den aktivierten Beads 2 bis 3 mal in 0,5 bis 1,0 ml PBS, Zentrifugation bei 20.000 g für 3 Minuten bei 25 ° C nach jeder Wäsche.
- Resuspendieren aktivierten Beads in 50 ul PBS.
- Dann werden 50 ul der IP mAb (at 0,2-1,0 mg / mL Lager-Konzentration) an die aktivierten Bead-Lösung.
- Mix für 3 bis 4 Stunden bei 25 ° C, indem man das Rohr auf einer vibrierenden Schüttler. Schütteln Sie genug, um zu verhindern Absetzen der Perlen auf dem Boden des Röhrchens.
- Wash mAb-gekoppelten Kügelchen von 2 bis 3 mal in 0,5 bis 1,0 ml PBS, Zentrifugation bei 20.000 g für 3 Minuten bei 25 ° C nach jeder Wäsche.
- Resuspendieren der Beads in 100 ul QBS Buffer. Diese können bei 4 ° C gelagert werden
- Aussetzung der Kügelchen gut, verdünnte 1:200-1:10,000 in PBS und zählen mit einem Hämacytometer. Die Konzentration muss für jeden präparativen Batch gemessen werden, so dass die Anzahl der Kugeln in jede IP-oder Pull-Down-Experiment verwendet genau gesteuert werden kann.
2. Post-nukleare Lysate Vorbereitung und Ip
Die Lyse-Verfahren und optimale Lysebedingungen wird nach Zelltyp und Protein-Protein-Interaktionen untersucht abhängen. Eine Reihe von Protokollen vorhanden und können für Ihre Anwendung geändert werden.
- Lyse 20 x 10 6 "kleine" Zellen, wie Lymphozyten oder 5 x 10 6 "große" Zellen, wie Makrophagen oder Tumorzellen, in 100 ul frisch Lysepuffer in einem 1,5-ml Mikrozentrifugenröhrchen für 20min auf Eis. Skalieren Sie die Lyse Volumen je nach Bedarf.
- Zum Entfernen Kerne und unlöslichen Zelltrümmer, Zentrifuge das Lysat bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand und entsorgen Sie die Pellets.
- Add 0,5 x 10 5 bis 2,5 x 10 5 mAb-gekoppelten Kügelchen, um das geklärte Lysat, Pipettieren vorsichtig mischen. Das Mindestvolumen wir nutzen, umSie eine einzelne IP ist 5 ul.
- Legen Sie auf einer vertikalen rotierenden Rad 4 Stunden bis über Nacht in einem kalten Raum. Set, um eine ausreichende Geschwindigkeit, um die Perlen Absetzen zu verhindern. Es ist akzeptabel für die Flüssigkeit der Low-Volume-IPs in den Boden des Röhrchens während der Rotation bleiben.
3. Probing der Bead-Capture-Protein mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern
- Waschen Sie die IP-Perlen zweimal in 0,2 bis 1,0 ml eiskaltem FCM-Puffer, Zentrifugieren bei 20.000 g bei 4 ° C für 3 min nach jeder Wäsche.
- Resuspendieren der Beads in 100 ul FCM-Puffer und 20 ul Aliquot in jedem der fünf oder mehr 1,5-ml-Reaktionsgefäße oder Vertiefungen einer Kamin-Bodenplatte.
- Add Fluorochrom-konjugierten mAbs zu den Proben. Führen Sie die FCM nach der Anweisungen des Herstellers oder nach empirisch ermittelten Konzentrationen Fleck. Als Ausgangspunkt, fügen Sie 0,2 bis 1 ul der Lager-Antikörper-Lösung (bei 0,2-1,0 mg / ml) pro Röhrchen oder gut, und Inkubation für 40 min auf Eis.
- Wash sondiert Perlen in 1,5-ml-Röhrchen zweimal in 1,0 ml eiskaltem FCM-Puffer, Zentrifugieren bei 20.000 g bei 4 ° C für 3 min nach jeder Wäsche. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand nach jeder Wäsche, kümmert sich nicht um die Perlen zu stören. Für einen Kamin-Bodenplatte, waschen zweimal mit 0,2 ml eiskaltem FCM-Puffer, Zentrifugation bei 1000g für 5 min bei 4 ° C nach jeder Wäsche. Ein Mehrkanalpipette ist nützlich für diesen Schritt. Zum Entfernen von Perlen in einem Kamin-Bodenplatte Überstand, "Flick" die Platte einmal, dann, während noch upside-down, blot keine tropft von den Rändern der Vertiefungen. Das Restvolumen in jede Vertiefung, die die Perlen, etwa 20 ul werden.
- Resuspendieren der Beads in 200 ul FCM-Puffer pro Probe. Transfer zum gekennzeichnet FACS-Röhrchen. Die Proben sind nun bereit für FCM.
4. FCM Acquisition
Die CML Perlen in diesem Protokoll beschrieben werden 3 bis 5 um im Durchmesser, etwa die Hälfte des Durchmessers eines ruhenden Maus-Lymphozyten. Daher kann es notwendig sein, manuell erhöhen die Forward Scatter (FSC) amp zu gewinnen und den Side Scatter (SSC) Spannung, um für die Bevölkerung der Raupe Ereignisse auf der Skala zu registrieren. Einzelne IP-Perlen sollten eine einzige dicht gruppierten Bevölkerung. Die Einstellungen und Tor sollte so eingestellt werden bead Dubletten und Schmutz auszuschließen.
- Vor dem Ausführen von Perlen oder Kügelchen Standards, entfernen Sie die Tropfen Containment-Hülle, die den Probeneingang umgibt auf einigen Zytometern. Lassen Sie den Mantel Flüssigkeit zwischen den Proben tropfen, da dies den Einlass klar werden und verhindern, dass Perlen aus wurden auf das von einer Probe zur anderen.
- Verwenden Sie unmarkiertem Perlen, eine negative Kontrolle der Fluoreszenz, und Rainbow Calibration Partikel (RCPs), eine positive Kontrolle der Fluoreszenz, um die Einstellungen so anpassen, dass sowohl die negativen und positiven Fluoreszenz Extremen gleichzeitig auf dem log-Skala x-Achse. Dies gewährleistet, dass die Fluoreszenz der experimentellen Proben werden auch auf-Skala. Beachten Sie, dass RCPs kleiner als die CML Perlen sind, so FSC-und SSC-Parameter sowie Schieberstellung, müssen eventuell vorübergehend für diese Probe verändert werden.
- Zurück zu unmarkiertem-Bead-Einstellungen einmal Kalibrierung mit RCPs abgeschlossen ist. Wenn nur eine fluoreszierende Sonde pro Probe verwendet wird, ist keine Fluoreszenz Kompensation notwendig. Im Allgemeinen Sonde wir Multiproteinkomplexen mit einem Fluorochrom-konjugierten mAb pro FCM Probe, und wir untersuchen vielfachen Wechselwirkungen Partner durch Färbung parallel Perle Proben mit mAk spezifisch für die verschiedenen Untereinheiten.
- Erfassen und Speichern des Fluoreszenz-Dateien. Die Analyse kann dann unter Verwendung der Durchflusszytometrie Software wie CellQuest, FlowJo oder CFlow werden.
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. IP-FCM für TCR/CD3 Multiproteinkomplex. T-Zellen aus der Maus-Stamm BALB / c wurden in 1% Digitonin lysiert und das Lysat wurde auf IP-FCM unterzogen Verwendung von Anti-CD3ε Perlen. Die erfassten Komplexe enthalten erhebliche Mengen an TCR-β (lila-Region) und Co-assoziierte CD3-ε (grün), aber nahe Hintergrundbelastung (definiert durch die irrelevant Immunglobulin-Sonde, pink trace) von anderen Proteinen, wie Thy1.2, CD45 oder H-2K (d) (braun, orange und blau Spuren bezeichnet). Siehe ähnliche bisher veröffentlichten Ergebnisse 1-6.
Discussion
Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen ist äußerst relevant für die Analyse von vielen zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Abstammung Reifung, Zellzyklus-Progression und Apoptose-Kaskaden. IP-FCM bietet eine schnelle, quantitative und sensible Art der Wechselwirkung von Proteinen zu untersuchen und zu definieren Mitglieder Multiproteinkomplexen in nativer Konformation. Beads gekoppelt und inkubiert mit Zelllysaten in einem Tag und überprüft werden kann und analysiert den nächsten Tag. Ein 96-Well-Platte Format ermöglicht einer großen Anzahl von Proben, die gleichzeitig eine effiziente Datenerfassung für statistische oder Screening-Zwecke bieten analysiert werden. Unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen Standards, kann die Anzahl der Proteine, die durch jede Perle eingefangen geschätzt werden. Sehr wenig Ausgangsmaterial für die Erfassung und Erkennung benötigt wird, so beschränkt Proben und knappen Analyten kann noch für mehrere Interaktionen analysiert werden. Obwohl IP-FCM nicht erforderlich ist Gentechnik, Epitop-Tagging, Denaturierung oder in-vitro Mischen von Proteinen in einer nicht-physiologischen Umgebung, kann es mit diesen und anderen Techniken gekoppelt werden, wodurch es zu einem wertvollen und zugänglichen Tool mit Anwendbarkeit auf vielen biologischen Systemen.
Fehlerbehebung:
Viele IP-FCM Experimente erzeugen nützliche Protein-Interaktion Daten sie das erste Mal versucht werden. Allerdings kann die Optimierung von IP-FCM Antikörperkonjugation zu Perlen, Protein-Komplex zu erfassen, und fluoreszierende Sonde verbindlich zu verbessern.
Die Effizienz von IP Antikörperkonjugation kann durch Sondieren gekoppelt Perlen direkt mit einem anti-Immunglobulin-Antikörper bestimmt werden. Wenn dies die Effizienz gering ist, kann die Erhöhung der Konzentration von Antikörpern während der Kupplung ermöglicht mehrere IP-Antikörper an jeder Perle befestigen. Dies kann die Bindungskapazität der IP bead Charge, was zu einer erhöhten Aufnahme und Detektion von Analyten. Andere primäre-Amin-haltigen Molekülen (z. B. Tris, Rinderserumalbumin) sollte nicht während der Kupplung vorhanden ist, da diese mit dem mAb für bead Befestigung und führen zu niedrigen mAb Kopplung konkurrieren. Wenn die Konjugation von mAb an Perlen als problematisch erweist aus anderen Gründen, können Perlen statt an Avidin / Streptavidin gekoppelt werden, und biotinylierte Antikörper kann anschließend nicht-kovalent gebunden und für die Immunpräzipitation.
Trotz guter Antikörperkonjugation kann anfänglichen Erkennung von bead-assoziierten Fluoreszenz gering sein. Zunächst komplexen Erfassung selbst kann niedrig sein. Da IP-FCM hängt von der Konzentration von Analyten, die Erhöhung der Anzahl der Zellen pro Lyse Volumen lysiert erhöhen Analyt-Abscheidung und-Erkennung. Darüber hinaus kann Gefangennahme durch die Verringerung der Anzahl der IP-Kügelchen, die mit dem Lysat, die gefangen genommen Komplexe in weniger Perlen und führt zu einer erhöhten durchschnittlichen Fluoreszenz pro Bead wenn sondiert vertreibt inkubiert verbessert werden. Zweitens ist es möglich, dass der Zugang der Sonde Antikörper, um das aufgenommene Komplexe sterisch durch die immunoprecipitating Antikörper behindert. In diesem Fall kann das Problem durch den Einsatz verschiedener Antikörper und / oder die Sonde erfassen angesprochen werden.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Eagles Innovation Award (Fraternal Order of Eagles) und von der Mayo Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
