Summary
A fim de examinar a expressão gênica no tecido da asa pupal de Bicyclus anynana, apresentamos um protocolo otimizado para em hibridizações in situ usando riboprobes. Nós também fornecemos diretrizes para a otimização deste protocolo para o uso em asas pupal das espécies de Lepidoptera outros.
Abstract
Apresentamos aqui, em formato de vídeo, um protocolo para a hibridizações in situ nas asas pupal do Bicyclus borboleta anynana usando riboprobes. Em hibridizações in situ, um dos pilares da biologia do desenvolvimento, são úteis para estudar os padrões espaciais e temporais da expressão gênica no desenvolvimento de tecidos ao nível da transcrição. Se os anticorpos que alvejam os produtos de proteína de transcrição de genes ainda não foram desenvolvidos, e / ou existem múltiplas cópias do gene de uma proteína específica no genoma que não podem ser diferenciados utilizando anticorpos disponíveis, em situs pode ser usado em seu lugar. Enquanto um in situ para discos asa larval tem sido disponibilizados para a comunidade de borboletas por vários anos, o atual protocolo foi optimizado para as asas maiores e mais frágeis pupal.
Protocol
DIA 1
- Prepare as seguintes soluções:
- PBS 10x
- 1x PBS
- 1x PBT
- 2 O DDH
- Adicionar DEPC 0,1% para volume total e agitar soluções vigorosamente.
- Autoclave.
- Fix paraformaldeído 4% - usando PBS-DEPC
- Proteinase K solução - se precipitar está presente vortex, vigorosamente antes de retirar alíquota
- Tampão de digestão Parar
- Tampão Prehybridization
- 50:50 PBT: Buffer Prehybridization
- Tampão de hibridização
- Soluções devem ser mantidos RNase-free. Use um vidro-ware que foi cozido (4 horas a 250 ° C) ou de plástico descartáveis. Pipetas sorológicas são muito úteis para a fabricação de soluções
- Dissecar as asas do tempo-encenado pupas em PBS
- Mover as asas diretamente para Fix tampão em poços de 24 placa de cultura bem à temperatura ambiente
- Fix discos por 2 horas
- Lavar 5 x 5 minutos em PBT
- Incubar as asas durante 3 minutos em solução de Proteinase K
- Enxágüe 2 x em Tampão Parar Digestão
- Lavar 5 x 5 minutos em PBT
- Lave 2 x 5 minutos em 50:50 PBT: PHB
- Lavar 1 x 10 minutos em PHB
- Incubar em PHB pelo menos 1 hora a 55 ° C.
- Calor desnaturam RNA sonda (20-50ng necessários por poço) (80 ° C por 5 minutos) e adicione a tampão de hibridação (100 l necessária por poço)
- Adicionar sonda para os poços e incubar 48 horas a 55 ° C
DIA 3
- Lavar 4 x 5 minutos em 55 ° C PHB
- Incubar durante a noite em PHB, a 55 ° C
DIA 4
- Prepare as seguintes soluções:
- Buffer do bloco de anticorpos
- Lavar 1 x 5 minutos em 50:50 PBT: PHB
- Lavar 4 x 5 minutos em PBT
- Asas incubar por 1 hora em buffer do bloco a 4 ° C
- Incubar as asas em uma diluição 1:2000 do anticorpo anti-Dig overnight a 4 ° C
DIA 5
- Prepare seguintes soluções:
- Tampão de detecção
- Solução em desenvolvimento - (embrulhe em papel alumínio) sensível à luz
- Lavar 3 x 5 minutos em PBT em temperatura ambiente
- Lave 7 x 5 minutos em PBT
- Enxágüe asas duas vezes em tampão de Detecção
- Desenvolver asas em 1 ml de Desenvolvimento de Solução - tempo de desenvolvimento deve ser monitorada a cada vez - vezes em desenvolvimento podem mudar até mesmo quando se utiliza as mesmas sondas e solução em desenvolvimento - em geral, verificação após 5-10 minutos e depois aumentar os intervalos até durante a noite. Placa deve ser envolto em papel alumínio para evitar exposição à luz, quando não verificar amostras.
- Enxágüe cinco vezes em Tampão parar de desenvolver
- Monte asas.
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Discussion
Otimização dos protocolos existentes
Em hibridizações in situ em discos asa larval foram realizados com sucesso usando os discos de borboletas Precis coenia (Carroll et al, 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. O protocolo atual foi adaptado de um protocolo detalhado disponíveis mediante solicitação por escrito do Laboratório Carroll para colorações asa larval. As mudanças que fizemos servem para acomodar as diferenças entre os tecidos asa de larva e pupa. Durante pupal dissecções asas posteriores, a membrana peripodial devem ser removidos e não incluídos nos poços. O tempo de posição inicial é muito maior em nosso protocolo, mas a etapa de pós-fix foi removido. Descobrimos que uma diluição de 10 vezes a solução de Proteinase K foi necessário para o tecido da asa frágil pupal enquanto ainda permitindo a penetração da sonda de sucesso. Nós também descobrimos que o bloqueio das asas antes de coloração de anticorpos muito reduzido de fundo, enquanto que o aumento da incubação de anticorpos durante a noite a 4 ° C aumentou a intensidade do sinal.
Aplicações
As aplicações deste protocolo são múltiplas. Ser capaz de localizar a expressão de um gene candidato em uma asa desenvolvimento pupal será o primeiro passo para implicando deste gene em algum papel funcional durante asa ou asa de desenvolvimento de padrões (Marcus et al 2004;. Ramos et al 2006).. Se vários genes que são conhecidos por interagir em outros sistemas são co-expressos juntos nas asas isto pode implicar a cooptação de mais redes gene elaborada na especificação de padrões de asa romance (Monteiro et al. 2006). Asa de borboleta padrão de evo-devo fornece um sistema rico onde pertinentes evo-devo questões que envolvem os processos de gene e da rede de genes co-opção, a evolução de novidades, a evolução de traços convergentes e paralelos, gene a evolução da homologia serial, e de duplicação e sub-funcionalização podem ser estudados de forma integrada. Além disso, borboletas exibir uma desconcertante variedade de padrões de asa que desempenham um papel no reconhecimento de espécies, a seleção sexual, mimetismo, termorregulação, e evitar predadores. Compreensão tanto da base genética e de desenvolvimento por trás da geração destes padrões, bem como os fatores ecológicos que favorecem certos padrões pode levar-nos a uma compreensão holística do processo evolutivo e dos preconceitos e limitações impostas por este processo de desenvolvimento de sistemas.
Diretrizes de otimização para a adaptação às diferentes espécies
Ao adaptar esse protocolo para asas de diferentes espécies, a principal preocupação será fazer o tecido permeável à sonda, mantendo a integridade do tecido. Portanto, as etapas de fixação e permeablization terá que ser otimizado. Para Bicyclus asas pupal, descobrimos que uma correção 2 horas em temperatura ambiente em tampão PFA fresco e uma digestão suave Proteinase K é suficiente. Tecidos pode ser fixado até 12 horas a 4 ° C, se necessário, mas é possível para o excesso de tecido corrigir o que irá reduzir de sinal, os tempos de fixação de modo mais curtos são os preferidos. Tanto a concentração da enzima e do comprimento e da temperatura da digestão deve ser determinado empiricamente para cada tecido. A idade das asas também pode ser um fator significativo na digestão como as asas mais velhos terão mais elaboradas estruturas cuticulares e nay requerem um maior digestão. É importante lembrar que os preparativos Proteinase K que estão disponíveis comercialmente não são padronizados para uma atividade específica e, portanto, condições de digestão também pode precisar de ser ajustado ao alterar lotes. A permeabilidade dos tecidos também pode ser aumentada pela incubação em soluções de detergente, por exemplo, uma solução de 1% Triton X-. Isso pode ser acrescentado antes da etapa prehybridization.
Outra preocupação será a de otimizar o tamanho da sonda, regra geral ser maior é melhor. Bob Reed, que fez asa pupal no final de situs em Heliconius, sugeriu 300 bp como um tamanho de destino (comunicação pessoal). Sondas maiores, que podem aumentar a especificidade do sinal, pode ser hidrolisado para ajudar a sua entrada nas células. Em outros sistemas, no entanto, os pesquisadores usam rotineiramente um sondas kb sem hidrolisar-los. Aqui usamos sondas em torno de 300bp, assim que funcionou muito bem.
Trabalhando com riboprobes pode ser intimidante para laboratórios não é usado para manipulação de RNA. Nós descobrimos que esta técnica seja bastante robusto e para conter várias etapas que minimizam a perda da sonda devido à atividade RNase. A Proteinase K digestão irá remover contaminação RNase ea formamida 50% dos buffers prehybridization / hibridação vai inibir a atividade RNase (Chomczynski 1992). Por isso, incentivamos as pessoas a usar riboprobes que aumentam a especificidade do sinal e não são tão assustadores como alguns podem pensar.
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Acknowledgments
Agradecemos a Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche suporte técnico para ajudar na resolução deste protocolo. Agradecemos também a William Piel para aconselhamento sobre a edição do filme.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
