Summary
Transplantation av isolerade öar har föreslagits vara en potentiell behandling för typ 1-diabetes. Här beskriver vi en metod att isolera öar från mus pancreata och transplantation dem till subkapsulär utrymmet i njuren.
Abstract
Sedan tidigt pionjärarbete Ballinger och Reckard visar att transplantation av Langerhanska öar till diabetiker gnagare kunde normalisera sina blodsockernivåer, har ö-transplantation har föreslagits vara en potentiell behandling för typ 1-diabetes 1,2. På senare tid har framsteg inom mänskliga ö-transplantation ytterligare stärkt denna uppfattning 1,3. Men två stora begränsningar hindrar ö-transplantation från att vara en utbredd klinisk verklighet: (a) kravet på ett stort antal holmar per patient, som kraftigt minskar antalet möjliga mottagare, och (b) behovet av tunga immunsuppression, något som avsevärt påverkar den pediatriska populationen av patienter som på grund av deras sårbarhet för långvarig immunsuppression. Strategier som kan övervinna dessa begränsningar har potential att öka den terapeutiska nyttan av ö-transplantation.
Ö-transplantation under musen njuren kapseln är en allmänt accepterad modell för att undersöka olika strategier för att förbättra ö-transplantation. Detta experiment kräver isolering av hög kvalitet kobbar och implantation av holmar till diabetiker mottagare. Båda metoderna kräver kirurgiska åtgärder som bättre kan påvisas genom video än med text. Här dokumenterar vi de detaljerade steg för dessa förfaranden genom både video-och skriftliga protokoll. Vi har också kort diskutera olika transplantation modeller: syngena, allogen, syngena autoimmuna, och allogena autoimmuna.
Protocol
1. Förberedelse och kalibrering av Liberase Reagens
- Detta protokoll använder Liberase TL (Roche, Cat # 05 401 020 001) enzym för pankreascancer matsmältningen.
- Köp 100-200mg på en gång och göra en stor sats. Återsuspendera frystorkat pulver i sterilt HPLC-kvalitet vatten så att koncentrationen är cirka 26 Wunsch enheter per ml. Detta bör vara ca 5 mg / ml. Se bipacksedeln för information om Wunsch enheter som finns i det specifika partiet. Placera rören på is i 30 minuter med icke-judiska virvlande några minuters mellanrum. Kontrollera att pulvret är helt upplöst i slutet av 30 minuter.
- Pool alla upplöst Liberase tillsammans och blanda försiktigt snurrar flaskan (INTE virvel eller skaka). Alikvotera 24,3 Wunsch enheter i förväg kylda Eppendorph rör, snabb frysning av flytande kväve (behandla det som alla enzymer) och förvara vid -80 ° C. Detta bör vara ca 0.935ml per Eppendorph rör. Varje delprov är avsedd för engångsbruk (tillräckligt för 11 möss) och bör inte förvaras eller frysas en gång tinats. I allmänhet är beståndet stabilt i minst 6 månader.
- För varje nytt parti, kalibrera den optimala inkubationstiden. Använd frysta papper, inte den nyligen upplösta lager, för kalibrering, för att efterlikna verkliga experiment så mycket som möjligt.
- Kalibrera vattenbad som du tänker använda för att exakt 37 ° C med en kvicksilver termometer. Använd samma inkubatorn i framtiden experiment.
- Före användning, tina en tub Liberase på is och lägg till den (0.935ml) till 21.6ml serum gratis RPMI, vilket gör den slutliga arbetar koncentrationen 1,08 Wunsch enheter per ml. Serum, BAS och EDTA hämmar Liberase. Zink och kalcium är kofaktorer. Förvara på is och använd inom 1,5 timmar. Detta är tillräckligt för cirka 11 möss (2ml/mouse).
- Se steg 2,3 för bukspottkörteln perfusion. BEGJUTA så många möss som möjligt i 1 tim. Använd sedan en eller två möss för varje inkubationstid och testa 10, 12, 14, 16, 18 minuters inkubation gånger. Om möjligt, inkludera 30 sekunders intervaller mellan gånger tidpunkten för matsmältning är mycket viktigt.
- Fyll i holmen isolering protokoll och analysera holme avkastning och kvalitet från varje inkubationstid punkt. Ytterst avkastningen ska inte ändra för mycket mellan högtrafik, men kvaliteten på holmar på dessa intervall kan variera. För efterföljande experiment, använda de tillstånd som resulterar i flest holmar som är hälsosamma 48 timmar efter isolering. Åldern på de möss tycks påverka den optimala inkubationstiden. Så använder möss i samma åldersgrupp. Helst använder 8-12 vecka gamla möss, men kan även 8-10 månader gamla möss som ger bra holmar. För kalibrering ändamål, använd yngre möss.
2. Kirurgiskt ingrepp
- Förbered all utrustning och media innan euthanizing holmen givaren möss.
- Autoklav eller låga sterilisera instrument före användning. Alla reagenser och instrument (röra prov) bör vara sterila. Isolering och hand plocka av holmar kan utföras utanför ett laminärt flöde huva utan att kraftigt öka förorenade. Dock är sterilisering av verktyg som kommer i kontakt med bukspottkörteln eller holmar avgörande för att undvika kontaminering. Följande verktyg behövs:
- 1 par dissekera sax för buksnitt.
- 2 par pincett.
- 1 BLODSTILLANDE pincett för att klämma ur gallgången.
- 0,419 mm i diameter metallnät.
- 0,1 mm i diameter nylon mesh.
- Böj flera 27 gauge nålar så att en 70 graders vinkel införs ungefär halvvägs ner på nålen. Den avfasade kanten av nålen ska möta insidan av armbågen.
- Fyll en sprayflaska med 70% etanol.
- Inrätta ett dissekera mikroskop med lämplig ljuskälla på ett lab bänk eller i en huva.
- Pre-chill centrifug till 4 ° C. Centrifugera måste ha en rotor swing hink, kunna 900xG, kylas och ha en paus som kan kopplas ur. På en Sorvall RT6000D med Sorvall H1000B rotorn är en 900xG hastigheten 2400RPM. Långsammare snurrar görs på 800RPM.
- Placera följande reagenser på is.
- RPMI (1 liter med 10% serum)
- RPMI (200ml utan serum)
- 50 ml koniska rör (1 för varje pankreas)
- 5ml sprutan.
- Jämvikt Histopaque1077 till rum Tempeperatur.
- Tina ett enda användningsområde alikvot av kalibrerade Liberase på is och späd i 22.5ml serum gratis RPMI. Serum, BAS och EDTA hämmar Liberase. Zink och kalcium är kofaktorer. Förvara på is och använd inom 1,5 timmar. Detta är tillräckligt för cirka 11 möss (2ml/mouse).
- Varm 37 ° C vattenbad.
- Har på handen så många möss som du kan cannulate i 1 timme (cirka 10 till 18 möss).
- Autoklav eller låga sterilisera instrument före användning. Alla reagenser och instrument (röra prov) bör vara sterila. Isolering och hand plocka av holmar kan utföras utanför ett laminärt flöde huva utan att kraftigt öka förorenade. Dock är sterilisering av verktyg som kommer i kontakt med bukspottkörteln eller holmar avgörande för att undvika kontaminering. Följande verktyg behövs:
- Förbered mus för kanylering. Först euthanize musen genom halsdislokation eller CO 2 kvävning. Medan mus löper ut, fyll 5ml spruta med 2 ml Liberase arbetar lager (1,08 Wunsch enheter / ml).
- Placera musen i liggande ställning på en pappershandduk vid dissekera omfattning och spraya buken med 70% etanol innan du öppnar sin mage med ett V-snitt från blygd regionen att båda frambenen. Vik huden över bröstet för att avslöja bukhålan.
- Placera musen med huvudet pekande mot dig. Leta i tolvfingertarmen inmatning av gallgången som lyfts fram i Fig.1. Detta kan göras utan att titta genom dissekera omfattning mål.
- Kläm fast tolvfingertarmen öppningen med hemostat som visats i Fig.2. Clamp position är avgörande för att blockera flödet av Liberase in i tarmen. Om klämman är för hög eller för låg, kommer Liberase BEGJUTA inte bukspottkörteln. Position hemostat, så att när komprimerade, går det precis längs pankreas / tarmen gränsen.
- Innan cannulating den djupa gallgången, kan det vara nödvändigt att flytta levern genom att trycka upp mot mellangärdet, så att hela längden på gallgången är utsatt (fig.3). När längden på gallgången exponerade, använd böjda 27-gague nål fäst vid Liberase förfylld spruta för kanylering. Det finns två tekniker för cannulating gallgången.
- I den första tekniken, eller "fri hand" metoden, spännas fast på hemostat på tolvfingertarmen dras bort från huvudet av musen mot svansen så att den gemensamma gallgången blir spända. Det finns ett sammanflöde i gallgången nära till levern där gallan rinner från gallblåsan och enzymer från levern samlas innan tarmarna. Insidan av V som bildas av denna sammanflödet exponeras genom att dra gallgången stram och är en idealisk plats att inleda kanylering av kanalen (Fig. 4). Om korrekt placerad, kommer nålen glida rakt igenom V, och direkt cannulate den nedre delen av kanalen. In nålen flera millimeter i kanalen innan fördela Liberase. Optimal nål placering är viktigt för att förhindra återflöde in i levern och gallblåsan. Dessutom är det viktigt att nålen inte sättas så långt att det hindrar mjälten kanalen. Den mjälten kanal är ett svårt att se gren av gallgången och det tömmer mjälten svansen i bukspottkörteln, en holme rikt område. Om nålen glider förbi öppningen för mjälten kanalen kommer det att finnas mindre än fullständig genomblödningen i mjälten svansen och eventuellt minskad nedbrytning av detta område. Optimal holme avkastningen inträffar när ditt nål djupet är tillräckligt långt att ingen Liberase flyr till lever / gallblåsa, men inte så långt att du har passerat mjälten kanalen. Du kan testa för framgångsrik kanylering genom att man avskaffar en liten mängd Liberase. Om du ser Liberase fylla kanalen då avstå resten av 2mls. Om området runt kanalen börjar fylla, stoppa dispensering, flytta nål, och försök igen.
- I den andra tekniken, eller "peang hjälpa" metoden, spännas fast på hemostat på tolvfingertarmen dras bort från huvudet av musen mot svansen så att den gemensamma gallgången blir spända. Sedan, med hjälp av böjda 27-gague nål fäst vid 5ml sprutan, punktera fascian nedanför gallgången nära levern. Använd nålen för att rensa fascian från kanalen (fig. 5). Med nålen fortfarande på plats, ställ in hemostat ner och plocka upp en pincett. Använd en gren av den öppna pincett för att lyfta upp gallgången där nålen har rensat fascia. Åsarna i pincetten skapa en tarmkanalen som du kan använda för att styra nålen i kanalen. Medan du drar i kanalen och pincett mot dig, skjut in nålen i kanalen med hjälp av pincetten som en backspärr. Test för kanylering genom att man avskaffar en liten mängd Liberase. Om kanalen börjar fylla (Fig.5 Arrow), avstå resten av 2mls. Om området runt kanalen börjar fylla, stoppa dispensering, flytta nål och försök igen.
- Som 2mls av Liberase fyller i bukspottkörteln, området nära tolvfingertarmen börjar expandera först, följt av regionen på toppen av magen, och slutligen mjälten svans (Fig. 6). Titta även för expansion av bukspottkörteln (Fig. 6). Om ett område börjar expandera och du inte ser den vita vävnaden jämnt expanderar och utspridning, är det troligt att den gemensamma gallgången inte har kanylerade, men nålen är inne i bukspottkörteln kapsel. Fyllning av kapseln med Liberase kommer inte att resultera i en hög holme avkastning som den yta som utsätts för enzymet kommer att vara låg. Om detta inträffar, stoppa perfusion och flytta nålen.
- När bukspottkörteln har perfusion, kan det tas bort från musen genom att dra det ur beröringspunkter med tarmar, mage och mjälte. Börja med att ta bort hemostat från tolvfingertarmen. Använd sedan pincett för att lyfta tolvfingertarmen och separera bukspottkörteln från tarmen med en andra pincett (FIG.7A-B). Detta görs genom att hålla den andra pincett stadigt och dra ut tarmarna ur buken. Därefter drar bukspottkörteln fria från toppen av magen och mjälten (FIG.7C-D). Slutligen lyfter bukspottkörteln ur magen och skär den fri från den återstående fascian anslutningar (FIG.7E-F).
- Placera bukspottkörteln i en 50 ml koniska rör och lämna den på is medan du arbetar på den andra möss. Starta en 1 timmes timer. För maximal holme avkastning, rum endast 1 bukspottkörteln i varje rör. Det rekommenderas inte att lämna perfusion pancreata på is i mer än 1 timme, eftersom Liberase börjar försämra vävnad. I slutet av timmen, snabbt gå till steg 3,0 för alla pancreata som perfusion.
- Upprepa steg från 2,3 till 2,6 för övriga möss eller tills 1 timme timern startades i Steg 2,6 har gått ut.
3. Purifying Islets från perfusion Pancreata
- Innan holmar kan renas från bukspottkörteln, måste vävnaden rötas vid 37 ° C. Gruppera 50ml rören som bär perfusion holmar i en öppen botten rack som passar i 37 ° C vattenbad. Se till att alla lock är väl säkrad och rör dränka i 37 ° C vattenbad för exakt tid förutbestämda för det aktuella partiet Liberase (Se steg 1,4). I slutet av inkubationen, flytta rören till is och tillsätt RPMI1640 med 10% serum till 20mls per rör. Serum som innehåller media kommer att stoppa Liberase matsmältningen.
- Skildes vävnaden genom att skaka rören kraftigt 40 gånger på 10 sekunder. Detta steg är avgörande för optimal återhämtning av holmar. Även med optimal Liberase perfusion och väl kalibrerat koktiden kommer holme avkastningen låg om vävnaden inte bryts upp. Den aggressiva hantering av prover i det här steget verkar inte skada musen kobbar och är nödvändigt för att befria dem från exokrin cell kluster.
- Att separera holmar från smälta bukspottkörteln, utföra följande steg.
- Pool smält pancreata så att det finns cirka 2,5 pancreata per rör. Därmed kommer tio rören kondenseras till 4 rör med 50mls av media varje.
- Centrifugrör i 2 minuter vid 800RPM och 4 ° C.
- Häll av supernatanten och suspendera pellets i 15-25mls media med 10% FBS genom att vortexa försiktigt (justera vortex intensitet till ca 50% av max) i flera sekunder.
- Häll den suspenderade slammet genom 0.419mm ståltrådsnät och tratt i en ny 50 ml koniska rör. Detta skiljer ut icke-smält vävnad, fett och lymfa. Skölj den första röret med en extra 10mls av media som innehåller 10% FBS och häll genom trådnät. Upprepa denna process för de återstående rören.
- Centrifugera rören i 2 minuter vid 800RPM och 4 ° C.
- Häll av supernatanten och Vänd försiktigt rören på ett hushållspapper. Titta att se till att den skär inte glider av. Torka insidan av rör med en pappershandduk för att avlägsna rester media, att vara noga med att inte störa cellpelleten. Återgå rör till en upprätt position.
- Resuspendera pellets i 5mls i rumstemperatur histopaque1077 genom att vortexa försiktigt i flera sekunder. Se till att suspensionen är homogen innan du lägger till en extra 5mls av histopaque runt insidan av röret. Detta tvättar små öarna på väggen i röret.
- Overlay histopaque med 10mls av serum gratis RPMI Var noga med att upprätthålla en skarp gränssnitt mellan histopaque och media. Lägg till media genom att pipettera långsamt längs sidan av röret med en hastighet av 1 ml per 10 sekunder. Medierna bör vara på toppen, och histopaque på botten. Serum påverkar tätheten av media och bör inte användas under detta steg.
- Spin prover i en centrifug jämvikt till 20 ° C vid 2400RPM (900xG) i 20 minuter med mycket långsam acceleration och inga bromsar. Detta steg skiljer holmar från exokrina celler. Holmarna kommer att migrera till gränssnittet mellan serum fria medier och Histopaque medan exokrina celler will bilda en pellet på botten av röret.
- Samla holmar från histopaque / media interface med en disponibel 10ml serologisk pipett. Holmar fastnar på glas, därför glaspipetter bör inte användas om de inte har silikoniserade. Placera holmar i en ny 50 ml koniska rör. Flera rör kan slås samman vid denna punkt. Fyll rören till 50 ml med serum som innehåller RPMI.
- Centrifugrör i 2 minuter vid 800RPM och 4 ° C.
- Häll av supernatanten och suspendera holmar i 50mls serum innehållande RPMI genom att vortexa försiktigt.
- Centrifugera rören i 90 sekunder vid 800RPM och 4 ° C.
- Häll av supernatanten och upprepa tvätta en längre tid.
- Häll av supernatanten och ta rör till vävnadsodling huven. Lägg penna / Strep till RPMI innehållande 10% FBS till en slutlig koncentration av 1% för att göra ön odlingsmedia. Resuspendera holmar i 5mls av denna kultur media.
- Invertera en 0.1mm sil nylon cell och placera den på en 15ml koniska rör. Sakta passerar den återsuspenderade holmen gödseln genom silen. Holmarna kommer att behållas av silen medan exokrina cellerna passera in i 15ml koniska röret. Detta steg ökar dramatiskt renhet holmar med avseende på exokrina cellen föroreningar i slutet av protokollet.
- Skölj 50ml koniska rör med en extra 6mls av media och pipett den genom sil.
- Plats 3mls av kultur media som en stor droppe i ett 10-cm petriskål. Vänd cellen sidan sil ända fram, så att ytan används för att fånga holmarna kan doppas i media droppe. Touching filtret till media kommer att överföra de flesta av holmarna till en icke-vävnadsodling behandlas petriskål. Använda en icke-behandlade petriskål är avgörande för att undvika holme vidhäftning och spridning till ytan på plattan. Fritt flytande öar är mycket lättare plockas för separation i experimentella grupper.
- Pipettera en ytterligare 5-7mls kultur-medier genom silen i petriskål att tvätta eventuella kvarstående skär bort av silen i skålen.
- Kontrollera holmen avkastning och kvalitet under ett 4x mål på ett inverterat mikroskop. Virvlande skålen i en tät oval samlar holmarna i mitten av skålen. Om holmar ser bra ut, de kan antingen hämtas omedelbart för experimentellt bruk eller separerade jämnt mellan 4-6 10cm Petri plattor (per 10 möss). Odling för många holmar i samma maträtt orsakar holmar att bli nekrotiska och förnedra. För experiment tycks 250-300 holmar per 6cm fat med 2-3mls av media att inte betona holmar.
- Det finns en del användbara holmar i 15ml koniska röret som samlat in 0,1 mm nylon flödescellen sil igenom. Dessa öar kan återkrävas efter 3-4 rundor av gravitationen sedimentering. Efter ca 4 minuter av sedimentering, aspirera alla utom cirka 1 ml av media från röret och fyll det till början av kultur media. Cap röret och invertera att blanda. Upprepa denna process flera gånger tar bort många av de enskilda celler cell exokrina som är långsamma till sediment, och berikar tyngre aggregat av endokrina celler (öar) som snabbt sjunka. Efter den sista längtan, resuspendera i 7mls kultur-medier och plattan i en ny petriskål.
4. Arbeta med Isolerad Islets
- Processen att isoleringen är ganska stressigt på holmarna, histopaque är giftigt, skakningar och centrifugering steg framkalla ren stress och uttagna värd blodförsörjning samt in vitro-kultur kan framkalla syrebrist. Vi och andra har visat att isolering inducerar beta-celldöd 4-5. Effekten från dessa påfrestningar ses av sårskorpa av celler från periferin av ön och mörkare och utvisning av den centrala kärnan av ön (central nekros). Medan sloughing av celler från periferin kan tolereras, diskvalificerar de centrala nekros av holmen den för användning i experiment. Oftast är det de större holmen, desto större är chansen att central nekros kommer att bli ett problem. Arbetet med att minska holmen postar svar isolering stressen ökar avkastningen av användbara holmar.
- Därför använder vi en tidigare rapporterat teknik för inkubering av holmar i 22-27 ° C vävnadskultur inkubator för de första 48-72 timmarna efter isolering 6-8. Detta minskade temperaturen dämpar holmar stress och jämnar deras övergång till in vitro-kultur. Om en 22-27 ° C vävnadsodling inkubator inte är tillgänglig, är det möjligt att uppnå önskad temperatur i en vanlig vävnadsodling inkubator genom att stänga av värmen kontroll och placera ca £ 20 förfrys tegel jämvikt till -80 ° C. Detta resulterar i ca 16-24timmar av minskad temperatur i inkubatorn. Byt -80 ° C frys tegel som behövs. Vi har inte observerats ytterligare dra nytta av inkubation vid denna lägre temperatur längre tid än 72 timmar.
- Förutom den låga temperaturen inkubation, rekommenderar vi att ändra media 24-48 timmar efter isolering. Utsöndras faktorer från stressad och döda holmar ansamlas i media efter isolering och kan främja ytterligare holme stress. För att ändra media, utföra följande steg.
- Överför media och skär från petriskål till en 15 ml koniska rör med hjälp av en plast pipett.
- Tvätta plattan med en extra 3mls av kultur media för att samla in kvarvarande holmar.
- Lägg till detta ytterligare 3mls till 15ml koniska röret och låt holmar att gravitationen sediment för 5min.
- Aspirera alla utom 1 ml media från 15 ml koniska rör, sedan resuspendera holmar i 4mls av holmen odlingsmedia.
- Överför holmar och media till en ny Petri platta. Lägg till ett extra 3mls av kultur media till 15ml koniska röret för att samla alla kvarvarande holmar och lägga detta till Petri plattan.
- Byt holmen media varje tre till fem dagar därefter.
- När plocka holmar för ett experiment, är det inte rekommenderat att blanda små öar från olika isoleringar. Den molekylära baslinje holmarna påverkas av många saker, bland annat hur mycket tid de har varit i kultur och isoleringen stress som varierar från prep att prep. För att minska variabiliteten ska holme experiment utföras på holmar som var isolerade på samma gång. Om detta inte är möjligt, vi starkt rekommenderar att samla alla holmar i en enda grupp innan de plockar dem för experiment. Att plocka holmar för experiment, utföra följande steg.
- Om holmar inkubera i mer än en maträtt, pool alla holmar i en enda maträtt genom att följa stegen 4.3.1 till 4.3.5 ovan. Om flera rätter av holmar är inblandade, bör en 50 ml koniskt rör användas i stället för 15 ml rör. Detta kan minska variation framkallas av subtila skillnader i kultur förhållandena mellan plattorna under efter isoleringen återhämtningsperiod.
- Under allvaret sediment av holmar, inrätta ett inverterat mikroskop utrustad med 4x eller 10x objektiv. Samla en P200 mikropipett och en låda av sterila P200 tips.
- Överför sedimenterade skär till en enda skylt och flytta plattan i mikroskop. Snurra plattan för att samla holmarna i mitten. Ta av locket på plattan och använd P200 pipetten för att plocka friska holmar. Friska holmar ha släta snowboardåkare och inga mörka regioner centrum (Figur 8). Försök att hålla en jämn fördelning av holmen storlekar under experimentella rätter holme storlek kan ändra svar på behandlingen.
- Antalet holmar per experimentella gruppen kan variera utifrån de behov av försöket. Vi bedömer att en holme har ca 1000-2000 celler och kommer att generera 0,3-1μg protein och 25ng av totala RNA. För in vitro, kan en typisk experimentella gruppen vara mellan 100 och 250 holmar pläterade i 35 mm eller 6cm rätter med 1-3 ml av media. För transplantation, kommer varje mottagare musen kräver mellan 150 och 400 holmar beroende på experimentell design (Se steg 5.2.2 och Diskussion för mer information).
- För att minimera ändringar som införts i handen plockprocessen använder vi öppning av P200-pipettspetsen som en guide för att uppskatta holme storlek. De flesta öar har en diameter ungefär hälften av öppning diameter, och vi räknar var och en av dessa som en standard holme. Varje skär större eller mindre än så, tilldelar vi en annan holme räknas därefter. Vi samlar holmar i partier med 20-50 och överföra dem till den utsedda experimentella rätter. Om P200-pipetten är satt till volymen 180 mikroliter, kan man samla flera holmar (vanligtvis mer än 50 holmar) i en spets. Således, även om holmarna plockas ett i taget, kan man samla in många holmar inom varje P200-spets genom att kontrollera pipetman låsmekanismen. Detta underlättar plockning av hundratals eller till och med mer än tusen av öarna som behövs för experiment. Vi använder även detta parti-wise operation för att hjälpa till att jämna ut fördelningen av holmar med liknande kvalitet och storlek.
5. Subkapsulär Njure ö-transplantation
- Framkalla diabetes hos möss transplantation mottagare.
- Placera möss på en 4 till 6 timmars fasta. Optimal transplantationspatienter bör vara mellan 6 till 10 veckor gamla och väger 20 till 25 g vid tiden för fort. För att snabba möss, ta bort mat från feeding rack och alltid placera möss i en ny bur. Detta garanterar en verklig snabbt genom att separera möss från alla rester av bitar av mat som tidigare kan ha fallit i deras bur. Plan för 80% till 90% av möss att bli diabetiker.
- Tre timmar in i snabbt, förbereda buffert natriumcitrat. Väg upp 0.735g enzym klass natriumcitrat (Na citrat, herr 294,10 g / mol) och lös den i 25mls sterilt avjoniserat vatten. Justera pH till 4,5 med hjälp av HCl. Denna buffert bör vara färsk för varje runda av experiment.
- Placera 0.05g Streptozotocin (STZ, M r 265,2 g / mol) i ett 1,5 ml Eppendorph rör. Detta belopp är tillräckligt för att framkalla diabetes i cirka 8 möss. Förbered ett tillräckligt antal 1,5 ml rör för antalet möss som ska injiceras. STZ är ljuskänsligt, så täcker varje rör med aluminiumfolie.
- Efter 4 timmar av snabb, resuspendera en tub STZ med 1 ml nybakade Na citratbuffert. När återsuspenderade förlorar STZ-Na citratlösningen aktivitet inom 15 till 20 minuter, så detta steg ska endast göras omedelbart före injektion i möss.
- Injicera varje mus intraperitonealt med en lämplig volym av STZ-Na citrat lösning för att uppnå en slutlig dos av 190mg/kg musen. Denna dos kan variera från stam och ålder mus, därför kan det vara nödvändigt att utföra en dosoptimering om förekomsten av diabetes är för låg eller om alltför många möss dör i 3 till 5 dagar efter injektion. Vanliga doser som används varierar från 150mg/kg mus till 250mg/kg mus.
- Supply mat och vatten när alla möss har injicerats.
- Testa möss för icke-fastande hyperglykemi (> 350mg/kg) 2 till 4 dagar efter injektion. Möss som visar tre dagar i rad av icke-fastande hyperglykemi kan användas som transplantationspatienter.
- Förbered holmar för transplantation
- Isolera holmar som beskrivs ovan i steg 2,0 till 4,0. Vid behov kan holmar isoleras på dagen för transplantation eller tidigare.
- Plocka holmar i grupper för transplantation genom att placera dem i sterila 1,5 ml Eppendorph rör. Håll rören på is. Antalet holmar behövs för att återställa normoglycemia kan variera med tanke på förutsättningarna för försöket (holmen donator stam, vikt och stam av mottagaren, och alla ytterligare behandlingar ges till mottagaren) och den person som plockar holmar. Storleken på mottagaren musen är en viktig variabel som påverkar minimalt holme nummer, som större möss kommer att kräva mer holmar. Vi finner genomgående att 150 till 250 holmar endast marginellt återställer normoglycemia medan 300 holmar eller mer botande i en 18 till 20gram C57BL / 6 mottagaren mus. I dessa försök var holmen donatorn möss antingen C57BL / 6 eller BALB / c.
- Transplant holmar att subkapsulär njure påsen
- Montera följande material (alla kirurgiska instrument måste steriliseras):
Tabell 1. Utrustning för transplantation25μl Hamilton Spruta 6 "av PE 50 slangar klippas så ena sidan är avfasade Gel lastning och P200 pipettspetsar Sterila Eppendorph rören (1 per mottagare) Isofluran och isofluran förångare Eppendorph provrörsställ McPherson-Vannas Scissors (1) Bent armen pincett (2) Peanger (1) Sår klipp med clips 27 gauge Flame drog glas kapillärrör sonder * Bomull tippas applikatorer 50 ml koniska rör med steril PBS Suturer Elektriska saxar 70% etanol Sprayflaska Kulspetspenna Betadine genomskinlig plast steril duk
* Observera: Vid utarbetandet av dessa sonder, försök att skapa en båge i sonden som härmar vinkeln på musen njure. Dessutom, se till att sondens ände är tillräckligt flammade poleras så att inga skarpa kanter finns. - Väg och märka alla diabetiker mottagaren möss. Tilldela varje mus till en experimentell grupp före transplantationen så att varje grupp liknande har matchas kroppsvikt.
- Inrätta ett kirurgiskt område inom en öppen främre huven försedd med gasen utloppet från Isofluran förångaren.
- Bedöva en mottagare mus med isofluran och sedan raka sina flanken med den elektriska saxen. Raka musen utanför det område där transplantationer kommer att utföras.
- Återgå musen för anestesi och placera den liggande vinkelrätt mot och direkt över axeln av en glasstav så att den rakade flanken uppåt. Spray flanken med 70% etanol. Musen är att vara förberedd med ett kirurgiskt scrub av omväxlande Betadine och alkohol upprepas tre gånger. Drapera musen med tydliga steril duk som ger tillgång till rakade flanken.
- Förbered holmar för transplantation medan musen är sövd. Gör detta genom att utföra följande steg.
- Placera en steril spets gel lastning i öppnandet av en 1,5 ml Eppendorph röret så att det finns en mjuk kurva som gör en u-form i den smala änden av spetsen. Öppnandet av spetsen ska vara riktad direkt upp ur Eppendorph röret. Inte inför en knut som helst i gelen lastning spets eftersom detta kommer att resultera i klippning av holmar och en minskning av antalet holmar som transplanteras.
- Ta försiktigt bort från is en tub holmar som utarbetades i steg 5.2.2. Alla holmar bör avgöras i botten av röret. Med hjälp av en P200 pipett försiktigt samla holmar i en minimal volym från botten av röret. Överlåtelse av dessa holmar genom den stora öppningen av gelen lastning spetsen som bereddes i steg 5.3.6.1. Holmarna ska bosätta sig i den smala långa eller smala begränsning av gelen lastning spetsen.
- Efter holmar har sjunkit, ta bort så mycket av media från gelen lastning spetsen som möjligt. Detta kan åstadkommas med ett nytt tips gel lastning bifogas en P200 pipett av aspirerande media genom den stora öppningen av holmen bärande gel loading spets.
- Överför sedimenterade holmar i PE 50 slangar (~ 15 cm i längd). Detta kan göras genom att först fästa icke-avfasade änden av röret för att den smala öppningen av holmen bärande gel lastning tips innan du ansluter tips till en P200 pipett. Holmarna kan sedan drivas igenom 60% av längden på slangen.
- Överför den lilla ön med PE-50 slang till en 25μl Hamilton spruta. Se till att sprutkolven har återkallats innan du överför röret. Anslut den icke-avfasade kanten av PE 50 slangen till nålen på sprutan.
- Tryck in sprutkolven tills holmarna är ungefär 0.5cm ifrån det avfasade öppning.
- Ställ in sprutan åt sidan så att den skär kan bosätta sig i en enda massa nära avfasade öppnandet av tuben när njurarna håller på att utarbetas för att ta emot holmar.
- Använd dina fingrar, lokalisera njurarna genom huden av musen under narkos. Axeln av kulspetspenna bör direkt under det område där njuren är belägen och placeras vinkelrätt mot ryggmärgen.
- När njuren är lokaliserad, använd McPherson-Vannas sax för att göra ett 2 cm snitt genom dermis direkt ovanför den i en riktning vinkelrätt mot ryggmärgen. Detta snitt kommer att utsätta den peritoneal väggen.
- Med McPherson-Vannas sax göra ett 1 cm snitt genom peritoneal väggen i samma riktning som skär genom huden skikt. Det är viktigt att öppningen som skapats av detta snitt vara mindre än njurarna utsätts.
- Med hjälp av skaftet på glasstaven som en backspärr, kraft njurarna genom peritoneal öppningen genom att trycka på the intilliggande yta. Om öppningen är något mindre än njuren kommer njurarna pressa genom öppningen och vila stabilt på ytan av musen utan ytterligare hantering eller kontakt. Denna placering är optimal för den efterföljande transplantation steg. Om öppningen är för stor, kommer njuren falla tillbaka in i bukhålan, vilket gör det svårt att slutföra följande steg.
- Blöt ytan av den exponerade njurarna med iskall steril PBS med en indränkt bomull tippas applikatorn. Upprepa detta steg efter några minuter eller som behövs för att förhindra njuren kapseln från att torka ut.
- Med hjälp av 27 gauge kanyl, göra en 0.2cm snitt genom njurarna kapsel över den främre ytan av njuren går från vänster laterala sida mot den högra laterala sidan.
- Använda lågan drog glaset kapillärrör sond skapar en påse mellan njuren kapsel och njure levervävnad. Gör det genom att föra in sonden via ett snitt i steg 5.3.12 och flytta den i en bakre riktning längs ryggens-laterala ytan av njuren. En idealisk sonden kommer att ha en böj i det som motsvarar den naturliga båge av denna yta i njuren. Detta gör att sonden att nå de mest bakre änden av njurarna utan att riva öppna en stor främre öppning. Det är viktigt att göra denna påsen så lång och smal som möjligt. Korta breda påsar är inte idealiska eftersom de tillåter holmar att fly från kapseln. Långa och smala påsar låta holmar som skall deponeras mot den bakre änden av njuren med minimal förlust från kapsulär påsen.
- Hämta 25μl Hamilton sprutan som bereddes i steg 5.3.6 och flytta skär till den yttersta kanten av avfasade öppnandet av det flexibla röret.
- Sätt avfasade kanten av slangar i subkapsulär påse som bereddes i steg 5.3.13. Den avfasade kanten ska vara vänd uppåt så att långsidan är i kontakt med njurarna parenkymet. Flytta slangen till de mest bakre änden av kapseln.
- Sakta överföra holmar från PE 50 röret i subkapsulär påsen genom att trycka in sprutkolven. Som skär fylla påsen långsamt tillbaka flexibel slang med att göra mer utrymme för de holmar som skall deponeras. Se till att alla holmar överförs från röret i påsen. Fyll inte påsen med luft eller överflödig vätska.
- Efter att PE 50 röret från påsen, använd lågan drog glaset kapillärrör sond för att försiktigt packa holmar i den proximala änden av påsen. Gör detta genom att skjuta glassond längs utsidan av njurarna rör sig i en främre till bakre riktning. Var försiktig att inte packa skär för hårt så den bakre änden av subkapsulär påsen kan spricka och släpp holmar. Detta steg minimerar förlusten av holmar från den främre öppningen av påsen när njuren placeras tillbaka in i bukhålan.
- Med hjälp av en böjd arm pincett lyft peritoneal slemhinnan intill öppningen görs för njure och sedan använda ett PBS indränkt bomull tippas applikatorn försiktigt in njuren tillbaka in i bukhålan.
- Stäng av musen genom att tillämpa suturer till peritoneal väggen och klipp sår i huden skikt.
- Återgå musen till sin bur och upprepa steg 5.3.4 till 5.3.19 för resterande möss. Möss ska hållas varm med en värmedyna under buren eller en värme lampa med det skyddade ögonen tills musen helt återhämtar sig från narkosen. Djuren bör förses med acetominophine i vattnet (6 mg / ml).
- Kontrollera icke-fasteblodsockernivåer 24 timmar senare. Alla möss bör normoglycemic (blodglukos <200mg/dl) vid efter operationen dag (POD) 1.
- Montera följande material (alla kirurgiska instrument måste steriliseras):
6. Representativa resultat
Två huvudsakliga tillvägagångssätt beskrivs i detta protokoll: (1) holme isolering och (2) ö-transplantation under njuren kapsel. I den lilla ön Isoleringsförfarande, holme ger intervallet vanligtvis mellan 100-150 holmar per musen beroende på ålder och stam. Renhet av dessa holmar med avseende på deras separation från exokrina cellerna i bukspottkörteln kan variera kraftigt mellan varje beredning. Men användningen av rumstemperatur Histopaque1077 i steg 3.3.7 och ett 0.1mm filter nylon i steg 3.3.17 tillåter normalt för mer än 99% renhet holmar. Denna renhet uppnås innan någon ytterligare handen plockning av holmar. Bilderna är av holmar följande isolering visas i Figur 8D. Som framgår av dessa bilder, de holmar har normalt en grov perifer gränsen omedelbart efter isolering. Men med tiden i kultur, kommer friska holmar förvärva och bibehålla en jämn kant (Figur 8D). I vissa holmar, kommer en central nekrotisk region utvecklas,framträder som ett mörkt område i kärnan. Detta nekrotiska centrum är ofta ut från den lilla ön som fångas av tidsförlopp imaging (Supplemental Video 1). Resterande holmar visas ihåliga i mitten (data visas inte) och förmodligen inte fungerar. Därför utesluter vi holmar med mörka centrum under handen plockprocessen. Viktigt fann vi att en låg temperatur inkubation efter isoleringen procedur (steg 4,2) drastiskt kan minska antalet holmar som kommer att utveckla centrala nekros i kulturen över tiden.
I ö-transplantation förfarande, två steg är kritiska: kemiska induktion av diabetes och leverans av holmar till njuren sub-kapsel området. För diabetes induktion, är målet att uppnå hyperglykemiska mer än 90% av STZ injiceras-möss. Dessa möss kommer att överleva utan transplantation i flera veckor. Den optimala dosen av STZ att nå detta mål varierar beroende på musstammar och ålder, och bör bestämmas av experimentellt. Vi fann att en skillnad så liten som 20mg/kg kroppsvikt kan göra stor skillnad. Därför bör en titrering med smala intervall genomföras. För ö-transplantation, är en viktig aspekt av modeller, som kan ha fyra immunologiska sammanhang: syngena, allogen, syngena autoimmuna, och allogena autoimmuna. I syngena modell är givaren stammen densamma som mottagaren stammen. Därmed skulle holmar inte åberopa det adaptiva-immunsvar från mottagarna. Detta gör att forskarna att utreda frågorna kring "primära icke-funktion", en term som hänvisar till holmen dysfunktion och förlust på grund av andra skäl än specifika avstötning av mottagarna. Primär icke-funktion tros vara den främsta orsaken till holme misslyckande i början av transplantation skede och för kravet på ett stort antal holmar (≥ 2 pancreata / patienten) för att uppnå euglycemia. Det är alltså en viktig fråga för ö-transplantation. I denna modell, en marginell holme massa som inte helt återställer normoglycemia bör användas och möss bör undersökas för blodsocker i ett tidigt skede efter transplantationen, vanligtvis mellan POD 1 till POD 7. Enligt vår erfarenhet är en marginell mängd holmar vanligtvis mellan 150 och 250 medelstor holmar per 20 gram mottagare med C57BL / 6 stam av möss. Med syngena modell kan man använda genetiskt eller farmakologiskt modifierad holmar att testa om en viss modulering påverkar den terapeutiska effekten av holmar i ett tidigt skede efter transplantationen.
I allogen och autoimmuna modeller, är den lilla ön ympkvistar utsätts för en specifik immun attack av värdlandet adaptiv immunitet, vilket innebär att T-lymfocyter, B-lymfocyter och andra immunceller. Adaptiv-immunitet är en fördröjd immunsvar, att analysera detta svar är det nödvändigt att transplantera ett mättar del av öarna som effektivt återställer normoglycemia i ett tidigt skede efter transplantationen för att minimera effekten av primära icke-funktion. Man kan då kontrollera hur lång tid innan de holmar avvisas vilket framgår av den förlust av normoglycemia att avgöra effekterna av eventuella ändringar av holmar på avstötning. Enligt vår erfarenhet är större än 300 öar som behövs per 20 gram mus och 15 till 21 dagar är avslaget tid för en allogen transplantation med BALB / C (H-2 d) som biståndsgivare och C57BL / 6 (H-2 b) mottagare.
Figur 1. Lokalisera tolvfingertarmen öppnandet av den djupa gallgången. Endogena matsmältningsenzymer rinner från levern, bukspottkörteln och gallblåsan passera genom gallgången innan tarmen på tolvfingertarmen. Flödesriktningen genom denna kanal kan vändas om tryck appliceras till systemet genom att lägga till extern vätska. Detta kommer att resultera i bukspottkörteln blir full och utspänd.
Figur 2. Fastspänning av duodenal öppnandet av den djupa gallgången. För att fylla i bukspottkörteln med Liberase är det nödvändigt att blockera duodenal öppnandet av den djupa gallgången. Om detta inte sker på rätt sätt, kommer Liberase fylla tarmarna istället för bukspottkörteln.
Figur 3. Ompositionering levern mot mellangärdet tillåter visualisering av den proximala region i gallgången. Kanylering av den djupa gallgången kan uppnås mest framgångsrikt, om det är försök till nära sin proximala ände (vid V-formade confluence beskrivs i 2.3.1).
Figur 4. Cannulating den gemensamma gallgången av den "friahand "metoden. En sammanflödet av gallgången syns när hemostat som spänns fast över tolvfingertarmen dras mot den bakre änden av musen. Kanal kanylering kan uppnås genom att placera 27 gauge på denna sammanflödet och kör genom den.
Figur 5. Cannulating den gemensamma gallgången av "pincett hjälpa" metod. Som nämnts i texten, ibland fascia vävnaden som omger kanalen gör det svårt att cannulate. (A) I dessa fall är det bra att rensa ansiktet lagret med 27 gauge nål. (B) kanal kan då tydligt visualiseras och stöds av ett par böjda armen tång. (C) med hjälp av pincett som en backspärr, kan 27 gauge föras in i kanalen för leverans av Liberase.
Figur 6. Även utbyggnaden av bukspottkörteln visar optimala nål placering. Med tanke på den genomskinliga typ av kanal och omgivande fascian vävnader, i vissa fall kan det verka som om kanalen har kanylerade när det faktiskt inte. Om detta inträffar och nålen tränger in i bukspottkörteln kapseln kommer tolvfingertarmen regionen i bukspottkörteln börjar växa vid leverans av Liberase. Dock kommer hela bukspottkörteln inte perfusion och detta kommer att leda till låg holme avkastning. För att undvika detta problem, se även för utbyggnad av bukspottkörteln som specifikt letar efter tecken på enzymet in regionen i bukspottkörteln knutna till den främre delen av magen.
Figur 7. Ta bort perfusion bukspottkörteln. För att ta bort bukspottkörteln från mus måste flera beröringspunkter med inälvorna brytas. (AB) Separera bukspottkörteln från tarmarna. (C) Separera bukspottkörteln från magen. (D) Separera bukspottkörteln från tarmarna. (EF) Skär eventuellt återstående kontakt med bukhålan.
Figur 8. Representant bilder av holmar. Den relativa renheten och kvaliteten på de holmar kan uppskattas mikroskopiskt efter slutförandet av isolering förfarande. (A) Även om målet är att rena skär från bukspottkörteln, exokrina celler och skräp ibland närvarande. (B) stress holmen isolering kan leda till celldöd som yttrar sig som mörka centrala delarna av kobbar och sloughing av celler från holme periferin. (C) när plocka holmar för ett experiment, undvika plocka förorena exokrina celler. (D) Islets förändring i utseende med tiden i kultur. Som holmar återhämta sig från isolering, få de en slät perifer yta. Ibland i större holmar en mörk central region är synlig. Dessa celler färgas positivt för celldöd.
Kompletterande Video 1. Långtidssekvenser mikroskopi av post-isolering holmar. I denna 16hr tid förflutit video holmarna kan ses utveckla nekrotisk centra som i slutändan har matats ut. Vänligen klicka här för videon .
Discussion
I avsnitten ovan beskrivs vi detaljerade steg för att isolera och transplantera holmarna musen bukspottkörteln. Här lyfter vi kortfattat de steg som är kritiska för framgång förfaranden.
1. Holme isolering
De viktigaste stegen är att identifiera en optimal enzymatisk koktiden (1,4), placera hemostat klämman över tolvfingertarmen öppnandet av den gemensamma gallgången (2.2.3), cannulating den gemensamma gallgången (2,3), kraftig skakning av bukspottkörteln efter 37 ° C smälta (3,2), och avlägsnande av exokrina celler kontaminering (3.3.7 och 3.3.16). Dessa steg har en dramatisk inverkan på kvalitet, avkastning och renhet holmar. Kanske den mest tekniskt utmanande steg är kanylering av den gemensamma gallgången. I många möss kan gallgången vara svårt att visualisera grund av omgivande fascia. Därför är det vanligt att försök att cannulate det gemensamma resultatet gallgången i penetration av fascian vävnad bara. I dessa fall börjar Liberase att fylla den omgivande bindväven och inte BEGJUTA bukspottkörteln. Om detta följs, stoppa flödet av Liberase och flytta nålen så att den tränger in i lumen i gallgången. Med praktiken är det möjligt att snabbt identifiera den optimala positionen för nål placering och för att slutföra kanylering utan att skada spröda kanalen.
2. Ö-transplantation
De kritiska steg är STZ induktion av diabetes (5,1) och effektiv leverans av holmar till subkapsulär påsen (5.3.14-5.3.16). STZ är en naturligt förekommande glukos analoga som är selektivt toxiska för cellerna insulinproducerande β-cellerna i holmar 9. Detta händer emellertid selektiv toxicitet i ett relativt snävt koncentrationsintervall. Detta styrks av det faktum att höga doser av STZ kan resultera i en snabb (2-3 dagar) dödlighet i avsaknad av hyperglykemi. Därför bör försiktighet iakttas för att identifiera den optimala dosen av STZ för stammen och ålder på möss som används innan någon storskalig försöksverksamhet inleds. Den fysiska leveransen av holmarna till subkapsulär påsen är också ett viktigt steg. För att uppnå tillförlitliga resultat är det viktigt att minimera förlusten av holmar under förlossningen. Detta kan inträffa om det finns defekter eller tårar i njuren kapseln täcker påsen eller om den injicerade volymen är för stor. Skador på kapseln kan undvikas genom varsam och försiktig manipulation, och genom att använda släta glas sond för att förbereda subkapsulär påse. Dessutom kan injektionsvolym minimeras med noggrann borttagning av supernatanten i steg 5.3.6.3. Om supernatanten tas bort ned till nivån av sedimenterade holmarna, finns det vanligtvis mer än tillräckligt med utrymme i subkapsulär påsen till plats 400 till 500 holmar. Men om injektionen volymen är för stor, holmarna är mer benägna att läcka ut i påsen under transplantationsprocessen, äventyra reproducerbarhet av försöket.
Inom detta protokoll är det möjligt att ändra vissa av stegen och ändå uppnå tillfredsställande resultat. Dessa innefattar följande: (a) användning av ett annat enzym att smälta bukspottkörteln, (b) en annan metod för att leverera enzymet i bukspottkörteln, (c) användning av en kontinuerlig Ficoll-natrium-diatrizoate (FSD) gradient istället för den enda densitet Histopaque1077 steg, och (d) ö-transplantation till andra platser än njurarna subcapsule.
- I detta protokoll, Liberase används för att försvaga cell-cell kontakter inom bukspottkörteln. Liberase är huvudsakligen en blandning av högt renat collagenases som har visat sig användbara för att lösa ut öar från bukspottkörteln. Men mindre renade collagenases är kapabla att åstadkomma ett liknande resultat. Därför är det möjligt att använda olika kommersiellt tillgängliga enzympreparat för rötning i bukspottkörteln, så länge som matsmältningen villkoret är optimerad för att uppnå hög holme kvalitet, avkastning och renhet.
- Det är också möjligt att smälta bukspottkörteln utan duktal perfusion av enzym. Leverans av Liberase genom gallgången möjliggör maximal exponering av bukspottskörteln yta på enzymet. Detta resulterar i jämnare rötning i bukspottkörteln och större utsläpp av intakt holmar. Däremot kan andra åtgärder för att öka ytan av bukspottkörteln att enzymet ska användas. Till exempel kan mals bukspottkörteln innan inkubering det i Liberase eller direkt injicera Liberase via pankreas kapsel användas för att isolera holmar. Dock finns ingen annan metod för Liberase leverans så effektivt som perfusionen genom gallgången. Därför bör mals eller direkt injektion reserveras som en sista utväg, om gallgången är skadad och inte perfusable.
- En alternativ metod för att separera holmarna från exokrina celler innebäranvändning av en FSD lutning istället för Histopaque1077 10. Den effektiva separation av holmar från exokrina celler i detta protokoll beror delvis på att en densitet mellan de två celltyper. Histopaque1077 har densiteten 1,0771 g / ml vid 25 ° C. Vid denna temperatur är Histopaque tätare än de holmar, men mindre tät än den exokrina celler. Därför, under kraft centrifugering, Histopaque1077 pellets de exokrina celler medan lyfta holmar till ytan. I princip kan alla andra ämnen med en densitet som som kan separera holmar från exokrina celler att användas i detta steg och FSD gradienten är ett sådant ämne.
- När det gäller platsen för holmarna transplantation, är njurarna kapseln i detta protokoll ett av de få tänkbara platser. Medan njure subcapsule är de vanligaste rapporterade platsen för transplantation på möss har andra transplantation webbplatser visat sig vara effektiva och de inkluderar venen nedsatt portalen subretinal utrymme, testis, epididymis fett pad, mjälte, och även bukspottkörteln 11-14. Var och en av dessa platser har sina egna fördelar och utmaningar. Därför bör valet av en plats för ö-transplantation fastställas av riktade frågor och särskilda omständigheter i experiment.
Man tror att strategier som kan övervinna de begränsningar av ö-transplantation dramatiskt kommer att öka dess terapeutiska potential. Därför erbjuder användning av en mus-modell som beskrivs i detta protokoll till en attraktiv metod för att identifiera sådana strategier.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av RO1 DK064938 (till TH).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Liberase TL | Reagent | Roche Group | 05401020001 | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Histopaque1077 | Reagent | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Penicillin Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Sodium Citrate | Reagent | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Streptozotocin | Reagent | Sigma-Aldrich | S-0130 | |
| HCl | Reagent | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Isoflurane | Reagent | Vedco, Inc. | ISOSOL | |
| Glass Capillary Tubes | Equipment | Fisher Scientific | 22362574 | |
| Insulin Syringe | Equipment | BD Biosciences | 329461 | |
| 27 Gauge Syringe Needle | Equipment | BD Biosciences | 305109 | |
| Hamilton Syringe #1702 | Equipment | Fisher Scientific | 14813133 | |
| 10cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 6cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 07770212 | |
| 6-0 Suture | Equipment | Ethicon Inc. | 8726H | |
| PE 50 Flexible Tubing | Equipment | Fisher Scientific | NC9083963 | |
| 5ml Disposable Syringe | Equipment | BD Biosciences | 309603 | |
| 50ml Conical Tube | Equipment | BD Biosciences | 352098 | |
| 15ml Conical Tube | Equipment | BD Biosciences | 352097 | |
| 0.1mm Nylon Mesh | Equipment | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.419mm Wire Mesh | Equipment | Newark Wire Cloth Company | 0300241 | |
| Water Bath Incubator | Equipment | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| Dissecting Microscope | Equipment | Carl Zeiss, Inc. | Stemi SV6 | |
| Inverted Microscope | Equipment | Nikon Instruments | TMS | |
| Tissue Culture Incubator | Equipment | Napco | 6300 | |
| Dissecting Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS14393 | |
| McPherson-Vannas Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS500260 | |
| Curved Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS15915 | |
| Hemostatic Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS 500451 | |
| Isoflurane Nebulizer | Equipment | Smiths Medical | ISOTech 4 OHMEDA | |
| Swing Bucket Centrifuge | Equipment | Dupont – Sorvall | RT6000D | |
| Swing Bucket Rotor | Equipment | Dupont – Sorvall | H1000B | |
| pH Meter | Equipment | Mettler Toledo | 09313509 | |
| Gel Loading Tips | Equipment | Fisher Scientific | 05408151 | |
| p200 Tips | Equipment | USA Scientific, Inc. | 111-0730 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Islet transplantation as a treatment for diabetes. J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).
- Gangemi, A. Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol. Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).
- Zmuda, E. Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model. Diabetologia. , Forthcoming (2010).
- Bottino, R. Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment. Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).
- Markmann, J. F. The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression. Transplantation. 49, 272-277 (1990).
- Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts. Diabetes. 35, 83-88 (1986).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).
- Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells. Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).
- Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets. Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).
- Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts. Transplantation. 43, 747-749 (1987).
- Nasr, I. W. Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells. J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).
- Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats. Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).
