Summary
הזחלים תסיסנית melanogaster לספק מערכת מודל אידיאלי לחקור את המנגנונים של תחבורה axonal בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. באמצעות הליך זה, 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות ניתן להשוות את הזחלים סוג בר.
Abstract
תסיסנית melanogaster מתגלה כמערכת מודל עוצמה לחקר התפתחות ותפקוד של מערכת העצבים, במיוחד בגלל הגנטיקה נוח רצף הגנום שלו באופן מלא. בנוסף, מערכת העצבים הזחל היא מערכת מודל אידיאלי לחקור מנגנונים של תחבורה axonal כמו העצבים סגמנטלי הזחל מכילות צרורות של אקסונים עם גופי התא שלהם ממוקם בתוך המוח ומסופי העצב שלהם סיום לאורכו של הגוף. כאן אנו מתארים את הליך להדמיה של חלבונים בתוך שלפוחית סינפטית עצבים סגמנטלי הזחל. אם נעשה בצורה נכונה, כל המרכיבים של מערכת העצבים, יחד עם רקמות הקשורים כגון השרירים NMJs, נותרו על כנן, ללא פגע, ומוכן להיות דמיינו. 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות גזור, קבוע, מודגרות עם נוגדנים שלפוחית סינפטית, דמיינו ולעומת הזחלים סוג בר. הליך זה יכול להיות מותאמים עבור מספר נוגדנים סינפטי או עצבי ושינויים שונים והפצה של מגוון של חלבונים ניתן לצפות בקלות בתוך העצבים סגמנטלי הזחל.
Protocol
1. הכנה של ריאגנטים
- הכן 1x הצפת Dissection באמצעות 128 mM NaCl, 4mm CaCl 2, 4 מ"מ MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5mm ו סוכרוז 36mM. הפתרון PH ל 7.2 ולסנן לעקר.
- הכן את מקבע באמצעות דילול של פורמלדהיד 01:01 16% ו הצפת Dissection 1x.
- הכן 1x 1x PBT באמצעות בופר פוספט (PBS) ב-pH של 7.2 ו טריטון X-100 ביחס 1:100.
- הכן 5% שור סרום אלבומין (BSA) עם 0.01% Na אזיד ב 1x PBS.
2. הכנה Dissection
- מנות Sylgard משמשים לניתוח. הכינו את הכלים על ידי שפיכת Sylgard 184 אלסטומר בסיס סיליקון וריפוי תערובת סוכן לתוך צלחת פטרי. אפשר התערובת לחלוטין לחזק יבשה לפני השימוש.
- לפני לנתיחה, לאסוף זוג נקי של # 5 מלקחיים, זוג נקי של מספריים להב ישר vannas, וסיכות.
3. Dissection של הזחלים Instar 3 rd
- איסוף נדודים 3 rd הזחלים instar של גנוטיפ מסוים על גבי צלחת פטרי.
- שטפו את הזחלים במים deionized להיפטר המזון.
- מניחים על צלחת הזחל sylgard, עם למעלה בצד הגבי. פין הזחל בקצוות הקדמי ואת האחורי שלה.
- מניחים ירידה של הצפת Dissection 1x על הזחל ניצח. שימוש בסדר צביטה המספריים זחל על קו האמצע הגב לקראת סוף האחורי. בעזרת מספריים, לחתוך את הקוטיקולה הזחל מהקצה האחורי עד הסוף הקדמי.
- מניחים ירידה של מאגר חדש Dissection 1x על הזחל גזור. באמצעות סיכה, לבחור אחד לקצה הלטרלי של לציפורן קרוב לאמצע הזחל ואת הסיכה לציפורן. באמצעות סיכה אחר, להצמיד את קצה לרוחב השני של לציפורן כפי שמוצג בתרשים. שני פינים משמשים בכל צד לרוחב. ראה תרשים להלן.
- מוציאים בזהירות את המעיים, גופים שומן, קנה הנשימה, ומשאיר רק את המוח עם שתי האונות אופטיים הגרעינים הגחון עם העצבים סגמנטלי המצורפת. היתרה של ההליך מתבצע על צלחת sylgard.
4. קיבוע של הזחל גזור
- דגירה הזחל גזור ב לתקן במשך 30 דקות, על ידי החלפת לתקן כל 15 דקות.
- לאחר קיבוע, לשטוף את הזחל ב 1x PBT במשך 30 דקות על ידי החלפת חיץ כל 10 דקות. חשוב לציין כי הזחל תמיד צריך להיות חיץ.
5. נוגדן מכתים של הזחל גזור
- הכן את הנוגדן הראשוני על ידי דילול זה לריכוז המתאים BSA 5% עם Na אזיד ב 1x PBT. ריכוז אופטימלי יהיה שונה עבור נוגדנים שונים.
- החלף האחרון 1x PBT שטיפה בתמיסת נוגדן שהוכן הראשוני, דגירה בתא לח על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. החדר לח נבנית על ידי רירית צלחת פלסטיק עם קים, מגבונים ספוגה במים.
- למחרת, לשטוף את הזחל גזור ב 1x PBT במשך 30 דקות על ידי החלפת חיץ כל 10 דקות.
- הכן את הנוגדן משני על ידי דילול זה לריכוז המתאים BSA 5% עם Na אזיד ב 1x PBT, ו דגירה הזחל עם פתרון נוגדנים משני של 25 מעלות צלזיוס במשך שעה. עטפו את חדר לח בנייר כסף כדי למנוע את האור, כמו נוגדנים משני הם רגישים לאור.
- לאחר דגירה, לשטוף את הזחל ב 1x PBT במשך 30 דקות על ידי החלפת חיץ כל 10 דקות.
6. הרכבה ו ויזואליזציה של הזחל גזור
- לפני הרכבה הזחל בשקופית, להכין את השקופית על ידי הפצת שני הקווים האנכיים של לק באמצע, עם רווח מספיק להחליק כיסוי לשבת על (ראה תרשים). בואו הציפורן לק להתייבש לחלוטין.
- מניחים ירידה של חיץ גובר במרחב בין השורות מסמר אנכי פולנית בשקופית (ראה תרשים). השקופית מוכן כעת גובר.
- לאחר שאחרון 1x PBT לשטוף בעדינות להסיר את הסיכות לרוחב. היזהר שלא לקרוע את לציפורן.
- הסר בזהירות את שתי סיכות הנותרים להרים את הזחל עם מלקחיים והמקום הזחל אופקית בשקופית מוכן. ודא הזחל לא התהפך והוא הצד הגחוני בכיוון מעלה.
- בעדינות במקום להחליק לכסות על גבי החותם את הקצוות עם לק (ראה תרשים). הזחל הוא מוכן כעת להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
7. נציג תוצאות
איור 1: תמונת נציג של עצבים סגמנטלי הזחל מן סוג larv ברבאמצעות נוגדנים כנגד חלבונים סינפטיים חלבון שלפוחית ציסטאין מחרוזת (CSP, Zinsmaier et al. 1994). שים לב עצבים סגמנטלי הם מוכתמים בצורה חלקה. בר = 20μm
איור 2: תמונה מייצגת של עצבים סגמנטלי הזחל מן הזחל חלבון מנוע מוטנטים באמצעות נוגדנים כנגד חלבונים סינפטיים חלבון שלפוחית מחרוזת ציסטאין (CSP). שים לב עצבים סגמנטלי להראות הצטברות מסיבית כי כתם בהיר עבור CSP (חיצים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזחל עצבים תסיסנית סגמנטלי מהווים מערכת רבת עוצמה כדי לחקור מנגנונים בתחבורה axonal. אם 3 rd לנתיחה instar הזחל מבוצעת כראוי, כל הרכיבים של CNS, PNS, ורקמות הקשורים, כגון השרירים NMJs, ניתן לבדוק בתוך זחל אחד. אנחנו צריכים להתאים את הפרוטוקול מאחד שפרסם Hurd ו סקסטון (1996). פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם כדי לבדוק נוגדנים נוירונים אחרים, אבל אופטימיזציה של נוגדנים צריך להיעשות. הדגירה פעמים יסודי ותיכון נוגדן ניתן לשנות או צעד חסימת ניתן להוסיף. השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לחקור את תפקידו של החלבון עמילואיד מבשר 1 ו 2 Huntingtin בתחבורה axonal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
SG נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב באפלו ומ ג'ון ר Oishei קרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
