Summary
אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ"א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.
Abstract
הפונקציה של המיטוכונדריה בדור הסלולר של ה-ATP בתהליך של זרחון חמצוני זוכה להכרה רחבה. במהלך העשורים האחרונים חלו התקדמות משמעותית להבנתנו את הפונקציות של אחרים במיטוכונדריה מאשר הדור של אנרגיה. אלה כוללים את תפקידם אפופטוזיס, מתנהג כמו איתות האברונים, פיתוח יונקים ההזדקנות, כמו גם תרומתם תיאום בין מטבוליזם התא ובחלוקה של תאים. ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מווסתת על ידי המיטוכונדריה מבוסס על שיטות חזקים בידוד וטיפול של המיטוכונדריה שלם מרקמות של חיות מעבדה. המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף חומרים התאי, כולל מחקרים על עקום החוצה וחיות.
כאן אנו מתארים שיטה מהירה מפורט עבור בידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד. הכנה כזו של הלב חולדה המיטוכונדריה הוא אובייקט מצוין עבור מחקר תפקודית מבנית על bioenergetics הסלולר, הובלה של ביומולקולות, מחקרים proteomic וניתוח של דנ"א, חלבונים ושומנים במיטוכונדריה.
Protocol
הקדמה
המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף החומרים התאי. הם ניתן להשיג במהירות ובאופן אמין בכמות גדולה מן סוג בר או עקום החוצה וחיות. הנוהל הכללי מורכב לעיכול רקמת על ידי חלוקה טריפסין, ו צנטריפוגה ההפרש.
ישנם כמה תנאים שצריכים להישמר במהלך בידוד של המיטוכונדריה מרקמות שונות, כולל הלב (איור 1).
- רקמת צריך להיות טחון היטב, שכן הוא משפיע ישירות על תשואה של המיטוכונדריה שהושגו. רקמת הלב עדיף לקצץ במספריים מעוגלים קטנים ניתן ואחריו להשתמש במטחנת רקמות Latapie או, אם מטחנת רקמה אינו זמין, עיתונאים שום בקוטר מוצא חורים בקוטר של כ 1.0 מ"מ.
- זה הכרחי כדי לשמור על טמפרטורה של פתרונות בכל שלב. לכן התהליך כולו צריך להתבצע בחדר קר, וכל המכשירים פתרונות להיות מוכן ומקורר מראש. אם תנאי הטמפרטורה לא נשמרים מספר מאפיינים יציבים של התכשיר ניתן לאיבוד. מבנה מיטוכונדריאלי רגיש מאוד הקפאת כך overfreezing של ההשעיה (למשל במהלך צנטריפוגה) אינה מותרת, במיוחד אם מחקרים התחבורה פעיל חשובים.
- פרמטר חשוב הוא הזמן הארוך של ההליך; הבידוד יש לבצע במהירות האפשרית והכנת שהושגו יש להשתמש מיד. לכן, כירורגית כלי נגינה, פתרונות ומוצרי צריכה להיות מוכנה מראש.
חומרים ומכשירים
מכשירים
- מספריים ההפעלה סטרייט, נקודה חדה
- Curved מספריים
- מצבטים
- צלחת פטרי
- משפך קטן + חתיכת ניילון המסנן (prewashed)
- 6 כוסות 50 מ"ל
- שני stirrers מגנטי ושתי אמבטיות קרח
- אחת קרח גדול באמבטיה
- 2 מוטות מגנטיים קטנים
- ומדיות עבור גלולה גירוד
- צנטריפוגה צינורות
- לחץ Latapie רקמות (ניתן להחליף עם העיתונות השום)
- טפלון זכוכית homogenisers 20ml ו 1-2ml
- פסולת כוס
- Eppendorf צינורות להשעיה המיטוכונדריה דגימות הסופי לקביעת חלבון
- אמבטיות קרח
פתרונות (מחושב לפי 2 חולדות):
- חיץ כביסה: 0.3 סוכרוז M, 10 HEPES מ"מ (pH = 7.2), 0.2 mM EDTA (1000 מ"ל)
- חיץ בידוד: 0.3 סוכרוז M, HEPES 10 מ"מ (pH = 7.4), 0.2 mM EDTA, 1 מ"ג / מ"ל BSA (Sigma A6003) (100 מ"ל שהוכן למאגר כביסה). סרום אלבומין שור ניתן להחליף על ידי פחות יקר נטול חומצה אנלוגים שומן. המאגר זהה או וריאציות שלה איזוטוני יכול לשמש חיץ Resuspending.
- טריפסין (Sigma T8003) פתרון: 2.5mg/ml ב 1mm HCl (0.5 מ"ל)
- מעכבי טריפסין מסויה שעועית (Sigma T9128) mg/10 6.5 מ"ל של חיץ בידוד
פרוטוקול
התוכנית הכללית של ההליך מוצג באיור. 1. לבבות צריך להיות מקורר לרחוץ כביסה, חיץ רקמות חדרית נכרת, טחון homogenised במהלך הטיפול photolytic עם טריפסין. ההשעיה היא centrifuged במהירות נמוכה ואת supernatant המתקבל centrifuged שוב במהירות גבוהה יותר כדי לאסוף את המיטוכונדריה. בהתאם הניסויים המתוכננת למאגר resuspending יכול להיות מוחלף על ידי כל פתרון איזוטוני אחרים.
בעלי חיים הופסקה בהתאם בבריטניה "חיות (הליכים מדעיים) לחוק." על ידי נקע בצוואר הרחם בעקבות עריפת ראש. זה הכרחי כדי לחלץ את הלב מיד לאחר עריפת ראש של חיה, כך שאין עיכוב בין סיום החי מיצוי לב. אם הבידוד מקביל של הכבד המיטוכונדריה צפוי החולדות צריך להיות בצום לילה לפני הניסוי.
- להכין שלושה כוסות המכילות 40 מ"ל של הצפת כביסה. מגניב אותם באמבט קרח מלח במשך 3-5 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. ודא שלא overfreeze אותם ולהשתמש מיד אחרי עננים של גבישי קרח מתחילים להופיע.
- פתח את בית החזה של עכברוש הכרות ולחלץ את הלב. ודא חתכים קטנים ומיד להעביר את הלב פתרון הקר כקרח בכוס הראשונה. חונק את הלב כדי להסיר דם והכניס אותו לתוך הכוס השנייה. חזור על פעולה זו עבור כל הלב.
- יבש את ליבם על הנייר את המסנן. הסר את כל הדם שומן קרוש, auricles ו fasciae ובריכת רקמת חדרית.
- לרכך את הרקמה ונקווה במספריים מעוגלים קטנים על צלחת פטרי על קרח דק סביב 5 עד גודל החלקיקים הוא כ 1-2 מ"מ.
- שים את רקמות טחון לתוך העיתונות רקמות לעבוראותה דרך. שים לב כי כמות משמעותית של החומר יכול להישאר בעיתונות כך לאסוף את כל רקמת לב מהקירות התחתונה של העיתונות.
- העברת חומר לתוך כוס עם הצפת 50 מ"ל כביסה ומערבבים. ואז לסנן את ההשעיה דרך מסנן ניילון. שטפו את הרקמה טחון על 3 פעמים עם מסנן למאגר כביסה לבטל את תסנין.
- העברת רקמות נסחפו לתוך 20 מ"ל של הצפת כביסה ולמקם אותו באמבט קרח על stirrer המגנטי. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת טריפסין תחת בחישה מתמדת להפעיל את הטיימר. הכן עוד stirrer מגנטי, אמבט קרח וכוס second 50 מ"ל.
- בדקה ה 4 homogenise בקצרה את החלק ההשעיה על ידי שימוש בחלק קטן מצויד באופן רופף זכוכית טפלון homogeniser (10-15 מ"ל) עם כמה משיכות מעלה ומטה כדי לפזר את ההשעיה. לאחר homogenisation להעביר את ההשעיה לתוך הכוס השנייה. חזור על נוהל על בדקה ה 9, כך שתוכל לבצע את homogenisation ההשעיה שתי פעמים בסך הכל. לאחר 15 דקות של דגירה, להוסיף 10 מ"ל של בידוד המכיל מאגר מעכב טריפסין ו דגירה דקות 1.
- סנן את ההשעיה שוב דרך פילטר ניילון ולשמור את תסנין. איסוף החלקיקים חלק שמאל על לסנן homogenise דקות 1 ב 15-20 מ"ל של הצפת כביסה.
- מערבבים את homogenate עם תסנין ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 600g.
- בזהירות לסנן את supernatant שנוצר לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. הימנע זיהום על ידי גלולה ו צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g.
- לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה להתעלמות supernatant ולשטוף את 2-3 פעמים גלולה עם 1 מ"ל של השלכת למאגר שכבת לבנות ורכות שפת החיצונית. לשבור את גלולה עם המרית אלא למנוע את הכתם האדום של אריתרוציטים בתחתית. אם בתאי הדם יש לוס, להסיר את פיסות אדום ההשעיה לפני homogenisation.
- Resuspend גלולה עם homogeniser קטנה או לחילופין על ידי pipetting עדין. לדלל את ההשעיה עם Isolationbuffer יותר צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g.
- בטל supernatant, resuspend גלולה ב Resuspending הצפת (חיץ איזוטוני של בחירה) ו צנטריפוגות שוב.
- כתוצאה מכך חום גלולה המכילה מיטוכונדריה שלם נשטף. Resuspend גלולה בנפח קטן מאוד של חיץ איזוטוני על פי בחירתך.
באיור 1. Scheme הוכחת צעד אחר צעד בהליך של בידוד של הלב חולדה המיטוכונדריה. חלק למעלה, שלבים 1-9: שיבוש רקמות, טיפול homogenisation טריפסין ו; החלק התחתון, בשלבים 10-15: צנטריפוגה ההפרש.
Discussion
פרוטוקול מהיר מפורטות הבידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד מתואר. הכנה שהושגו יכול לשמש למחקר פונקציונלי או מבניים על bioenergetics הסלולר, מחקרים proteomic או ניתוח הדנ"א המיטוכונדרי ותוכן השומנים. מחקרים Biophysical תחבורה פעילה של יונים ביניים מטבולי ניתן גם לבצע. אפשר להמשיך בתהליך ההכנה המיטוכונדריה כדי לבודד את חלקיקי submitochondrial, הממברנה החיצונית או רכיבים נפרדים לטהר של זרחון חמצוני. השיטה המתוארת הוא שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי של בידוד על ידי יעקובוס ו סאקס 1. התשואה הצפויה של המיטוכונדריה מוכן הוא כ 10-15 מ"ג של חלבון לכל המיטוכונדריה לב ויחס השליטה על הנשימה Malate / גלוטמט הכנה כזה נע בין 8-12 עם הנשימה IV מדינת סביב 0.12 μmol O 2 חלבון xmin xmg -1 -1 ב 23 ° C במדיום המהווים 0.25 סוכרוז M, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM אשלגן זרחתי (pH 8.0) עם 150 מיקרומטר ADP לנשימה חניכה III המדינה (על תנאי הניסוי ותוספות המדויק, לראות נ"צ . 2).
תשומת לב מיוחדת יש לתת פרטים טכניים אחדים לפני תחילת ההליך בבידוד. זה חיוני כדי להשתמש לנקות צינורות פוליפרופילן או פוליקרבונט צנטריפוגות, ולכן צינורות יש לשטוף ביסודיות עם מברשת נקייה ומים חמים, אולם הטיפול אבקת צריך להישמר לכל הפחות. כמו כן, עדיף לאסוף את כל כלי זכוכית וכלי הכרחי בחדר קר יום לפני הבידוד.
במהלך הבידוד בעת העברת מאגרים של צלוחיות על כוסות, תשומת לב מיוחדת а יש לתת למנוע טיפות של מי קרח לתוך הפתרונות. כאשר הטיפול ברקמות יש להדגיש כי עקירת הלב צריך להתבצע בהקדם האפשרי מאז אפילו קצרת זמן העיכוב בין עריפת ראש של החיה וקירור רקמת תביא המיטוכונדריה זוגיים חלקית. קירור מהיר ושטיפת יסודית של לבבות להסיר חיונית כדי להשיג הכנה רגילה, ללא המוגלובין NADase כדורית אדומה.
טריפסין משמש השפלה חלבונים החיבור להגדיל את הרגישות של הרקמות לכפות הגז במהלך homogenisation. חשיפה ממושכת של הרקמה כדי פרוטאז יש להימנע שכן התוצאות במיטוכונדריה של איכות נחותה.
לאחר centrifugations מהירות גבוהה הקירות של צינורות צנטריפוגה יש לנגב עם נייר טישו כדי להסיר כל הפיקדונות של חומר השומן שהצטבר על הקירות.
עבור resuspension הסופי עדיף להשתמש בנפח נמוך של המאגר הסופי על מנת למזער אובדן של פונקציות המיטוכונדריה במהלך האחסון (150-200 μl של המאגר בכל לב). עבור מחקרים של הובלה של קטיונים divalent לא סוכני chelating חייבים להיות נוכחים לקראת הגמר המיטוכונדריה ולכן יש לשטוף כמה פעמים עם המדיום EGTA ללא בשימוש בתוך השעות הראשונות לאחר בידוד.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים פרופ 'וינוגרדוב וד"ר ורה Grivennikova עבור המבוא של המחברים לתחום הביולוגיה המיטוכונדריה תובנות ועצות שימושיות רבות בהליך זה. המחברים מודים לגברת אמנדה McKintock ממשרד התקשורת מאוניברסיטת קווינס על העזרה בהכנת וידאו.
References
- Jacobus, W. E., Saks, V. A. Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).
- Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).
