Summary
ونحن نقدم لإعداد بروتوكول مفصلة الخلايا الأولية فصلها عن
Abstract
نحن هنا تصف طريقة لإعداد وزراعة الخلايا الأولية من أجنة فصل المعيدة ذبابة الفاكهة. وتجمع في سطور ، وكمية كبيرة من الأجنة من الذباب ونظم الشباب وصحية ، وتعقيمها ، ثم فصلها ماديا في تعليق خلية واحدة باستخدام الخالط الزجاج. بعد أن مطلية على لوحات أو الثقافة أو الشرائح غرفة في كثافة متوسطة المناسبة في الثقافة ، ويمكن تمييز هذه الخلايا الى مزيد من عدة أنواع الخلايا شكليا ، متميزة ، والتي يمكن تحديدها بواسطة علامات على خلايا محددة. وعلاوة على ذلك ، فإننا نقدم لمعالجة ظروف هذه الخلايا مع مضاعفة الرناوات (DS) الذين تقطعت بهم السبل للحصول ضربة قاضية الجينات. ويتم إنجاز رني كفاءة في خلايا ذبابة الفاكهة الابتدائي بحلول الاستحمام ببساطة الخلايا في مستنبت المحتوية على الرنا المزدوج الجديلة. القدرة على القيام بأنشطة فعالة رني اضطراب ، جنبا إلى جنب مع غيرها ، والكيمياء الحيوية الجزيئية وتحليل التصوير الخلية ، وسوف يسمح للإجابة عن أسئلة متنوعة من ذبابة الفاكهة في الخلايا الأولية ، وخصوصا تلك التي تتصل العضلات متباينة ، والخلايا العصبية.
Protocol
1. إعداد أقفاص الطيران
- تنمو ذبابة الفاكهة (من النوع البري سلالات مثل ولاية أوريغون - R أو التركيب الوراثي وجدت) في حاويات ملائمة للحشرات مثل الكؤوس 32 اوز.
- نقل الذباب eclosed حديثا إلى أقفاص كبيرة لجمع الأجنة أو يطير أقفاص السكان.
- نقل الأقفاص في غرفة مع درجة حرارة 25 درجة مئوية ~ والرطوبة 65 ٪ ~ في ضوء ال 12 ساعة ومظلم 12 ساعة دورة لتسهيل جمع الأجنة متزامن.
- الحفاظ على الذباب في الأقفاص عن طريق تغذية منهم قتلوا لصق الخميرة يشوبه على لوحات دبس. تغيير لوحات دبس (مع لصق الخميرة قتيلا) مرة واحدة يوميا لمدة 2-3 د.
2. جمع الأجنة متزامن
- يوم الخلية الأولية إعداد ، وإطعام الذباب لوحات جديدة وث المغلفة مع الخميرة قتل لصق لفترة عن الملاعب ح 1-2 قبل.
- قبل 12 ساعة دورة الظلام ، واستبدال لوحات ما قبل وضع مع لوحات جديدة يشوبه الدبس مع كمية صغيرة من معجون الخميرة. تجاهل جمع قبل وضع ، الذي يحتوي على أجنة غير متزامن القديمة.
- جمع الأجنة لمدة ساعة. 1-2
- إزالة لوحات تحتوي على السكان متزامن نسبيا من الأجنة وتخزينها في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعة. وسوف تكون الأجنة في مرحلة متقدمة المعيدة في هذا الوقت.
3. جمع وغسل الأجنة
- تخفيف أجنة من لوحات الرسام مع الرطب ، وشطف جيدا بالماء الفاتر الاستفادة من خلال مجموعة من المناخل مكدسة ، بحيث جمع الأجنة في عيون غربال خيرة في القاع. شطف لبضع دقائق لإزالة الكثير من الخميرة وذبابة والحطام ممكن.
- غيض من المناخل بحيث تتراكم الأجنة في جانب واحد ، ويغسل بلطف أجبرتها على الفرار من غربال في سلة dechorionation.
- الانتقال إلى منطقة هود نسيج الثقافة دون السماح للأجنة تجف.
4. تجانس طلاء الأجنة والخلايا
- تعقيم وdechorionate الأجنة التي تخبط بها في 50 ٪ (المجلد / المجلد) لتبييض 5-10 دقيقة. شطف قبالة جدار الأجنة لسلة مع 70 ٪ (المجلد / المجلد) الايثانول. بدلا من ذلك ، يغسل قبالة الأجنة التبييض مع الماء المقطر قبل العلاج الايثانول. من هذه النقطة يجب أن يتم التعامل معها أجنة فصاعدا في ظروف معقمة وهود في النسيج الثقافي.
- شطف الأجنة بدقة لإزالة المبيض و / أو الإيثانول مع الماء المقطر تعقيمها.
- خلال الخطوة dechorionation ، ملء الخالط Dounce مع حجم المناسبة من درجة حرارة الغرفة المتوسطة M3 على أساس كمية من الأجنة. وينبغي أن النسبة بين حجم الأجنة وذلك من وسائل الإعلام لن يكون أكثر من 0.5 مل الأجنة : 40 مل وسائل الإعلام (أو الأجنة ~ 100-200 / مل).
- وضع الأجنة تشطف في الدورق المعقم مع كمية من وسائل الإعلام بما يكفي لغمر M3 الأجنة. السماح للأجنة ينقع لمدة 2-5 دقيقة.
- تفكيك سلة dechorionation وصمة عار على شبكة Nitex الجاف مع مناشف ورقية معقمة.
- نقل الأجنة في الخالط مع الفرشاة المعقمة.
- التجانس بلطف مع السكتات الدماغية باستخدام مدقة قصيرة فضفاضة دون أن تصل إلى أسفل الأنبوب حتى يتم تعليق جميع الأجنة. ثم بلطف ولكن بحزم ، والتجانس مع ثمانية من السكتات الدماغية الكاملة. لا يلوي مدقة وهو يتحرك صعودا وهبوطا.
- نقل جناسة الى العقيمة 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية إما عن طريق سكب أو pipetting ، وغطاء الأنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 40G ، ودرجة حرارة الغرفة لبيليه الانقاض الأنسجة ، وكتل كبيرة وأغشية الخلايا المحية. نقل طاف تحتوي الخلايا وصفار البيض لتنظيف الأنبوب وكرر الخطوة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق.
- بعناية نقل طاف بصب أو pipetting في أنبوب نظيفة وتدور لمدة 10 دقيقة في 360g ، درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا. تجاهل طاف. Resuspend الكرية خلية في 10 مل من مستنبت (المصل خالية المتوسطة للتجارب رني).
- عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات لتقدير كثافة الخلية. وفي الوقت نفسه ، كرر الخطوة 4.10 لخلايا بيليه.
- Resuspend الخلايا إلى التركيز المطلوب. لبدء ، محاولة مجموعة من 1 ~ 5 X10 6 خلية / مل وطبق بها في 1،7-2،5 الخلايا 5 X10 / سم 2.
5. رني الخلية الأولية للخلايا المزروعة في لوحة 384 جيدا
- الاستغناء عن 5 ميكرولتر من dsRNAs في كل بئر عند تركيز 250 نانوغرام النهائي ~ لكل بئر في 384 لوحة جيدا.
- استخدام ماصة متعدد القنوات ، موزعة 10 مل (1 ~ 4x106 خلية / مل) من الخلايا الأولية للبئر الواحد في المتوسط M3 المصل الحرة في لوحة 384 كذلك يحتوي على الرنا المزدوج الجديلة مختلفة في كل بئر. بدلا من ذلك ، يمكن تربيتها في 8 خلايا رفاه الشرائح الزجاجية لغرفة التصوير مبائر.
- لوحات لأجهزة الطرد المركزي 1 دقيقة في 300g ودرجة حرارة الغرفة. ثقافة الخلايا في المصل خالية المتوسط عند 25 درجة مئوية لمدة 22 ساعة أو عند 18 درجة مئوية لمدة 1-2 د.
- إضافة 30 مل من مستنبت المصل المحتوية على كل بئر. لوحات لأجهزة الطرد المركزي 1 دقيقة في 300g ودرجة حرارة الغرفة.
- وضع لوحات في غرفة رطبة والثقافة الخلايا الأولية للحصول على 5 ~ 7 د إضافية عند 25 درجة مئوية.
- صورة الخلايا الحية أو بعد تلوين المناعي.
6. ممثل النتائج :
في ظروف مثالية ، والخلايا في ثقافة تبدو صحية مع التشكل الجولة. وسوف يكون قليلا ثقافة الحطام الخلية ، وتكون 50 ~ 80 ٪ متموجة بعد الطلاء الأولي. وهذه الخلايا تغيرات شكلية بعد أن المثقف لفترة ممتدة من الزمن. يستغرق عادة حوالي 5-8 أيام للخلايا في الثقافة لتكون متمايزة تماما عند 25 درجة مئوية. وعادة ما يتم الحكم على الثقافات نوعية جيدة الابتدائي بحلول جيدا كيف يتم التمييز بين الخلايا من المصالح في مجال الثقافة. على سبيل المثال ، الخلايا العضلية الأولية وغالبا ما يكون التشكل فرع وتصبح شبيهة myotubes multinucleated مع شريطية مثل اللييفات العضلية التي تتكون من سلسلة من sarcomeres. سوف myotubes متباينة تماما وعادة ما تتحرك بشكل عفوي في الثقافة. في المقابل ، شكل الخلايا العصبية الأولية مجموعات متمايزة مع الهيئات زنزانتهم ، والتواصل مع المجموعات الأخرى مع الكابلات محوار بهم.
الشكل 1. الخلايا الأولية تغيرات مورفولوجية بعد مطلي في الثقافة
(أ) صورة مشرقة من حقل الخلايا الأولية اليمين بعد أن مطلي في بئر من 384 لوحة جيدا. غالبية الخلايا المستديرة وسليمة وفصلها بشكل جيد. (ب) صورة مشرقة من حقل الثقافة الخلية الأولية 20 ساعة بعد الطلاء. الخلايا الأولية تشكل بالفعل الكتل (الكبيرة رأس السهم) والعضلات مع التشكل فرع مثل (السهم طويلة) يمكن التعرف عليه في هذه المرحلة. (ج) وعلى النقيض من صورة المرحلة الابتدائية للثقافة 5 أيام بعد الطلاء. ثقافة تبدو أكثر تقدما ، مع امتدادات الخلايا العصبية (الأسهم الصغيرة) ، والتكتلات العصبية (النصال الكبير) والعضلات (متوسطة الحجم السهم).
الشكل 2. أمثلة من الخلايا الأولية تعامل مع dsRNAs المستزرعة في لوحة 384 جيدا
تم عزل الخلايا الأولية من أجنة تحمل Dmef2 - Gal4 ، D42 - Gal4 ، UAS - ميتو - GFP الجينات المحورة ، التي Dmef2 - D42 - Gal4 والتعبير Gal4 محرك ميتو - GFP في العضلات والخلايا العصبية الحركية ، على التوالي. تم علاج الخلايا مع dsRNAs تستهدف إما lacZ (AC) أو مضخمة (إذا) (مدافع). ويمكن رؤية كل من العضلات والخلايا العصبية من قبل الابتدائية GFP (A ، C ، D ، F). السهام البيضاء أشر إلى ملحقات العصبية. Phalloidin تلون أكتين (السهام) يكشف عن بنية العضلات مثل فرع في ثقافة التعامل مع dsRNAs lacZ (B و C) ، ولكن الجولة المتابعة العضلات التشكل في ثقافة التعامل مع حالة dsRNAs (E و F). في الصور المدمجة (C ، F) ، والملون الأصفر العضلات ، ولكن أحمر السلبية تظهر الخلايا العصبية وامتداداتها (السهام البيضاء)
الشكل 3. micrographs مبائر عضلات الأولية على الإنسان المثقف vitronectin المغلفة شرائح الزجاج غطاء
وكانت ملطخة immunofluorescently عضلات الأولية لمكافحة ذبابة الفاكهة مع Titin (KZ) (أحمر في الدمج) ومع phalloidin لأكتين (أخضر في الدمج). لوحات كبار هي عضلة التحكم من النوع البري وأخرى أسفل هي sals (CG31374) رني العضلات مع sarcomeres اختصارها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن للنمط التنموية الثقافات الرئيسي للخلايا ذبابة الفاكهة تختلف اختلافا كبيرا ، ربما يعود ذلك الى العديد من المتغيرات أثناء عملية التحضير الخلية الأولية. ينبغي أولا وقبل كل شيء يطير المستخدمة لوضع البيض يكون الشباب (في غضون أسبوع من العمر) والصحية (خالية من عدوى فيروسية أو بكتيرية). ويجب تجنب أجنة غير مخصبة أو المصابين ، كما أنها غير مجدية والخلايا المشتقة من هذه الأجنة لا يمكن التفريق ، وسوف البقاء على قيد الحياة فقط لمدة 1-2 أيام. الثانية ، خلال عملية التجانس ، فمن المهم ألا نسرف في الخالط مع عدد كبير جدا من الأجنة. وإثقال كاهل الخالط مع عدد كبير جدا من الأجنة يسبب زيادة في كمية من الحطام وعددا من الخلايا الميتة ، مما سيؤثر على تمايز الخلايا في نهاية المطاف. أخيرا ، ينبغي مطلي الخلايا في كثافة المناسبة لضمان حسن تمايز الخلايا الأولية. وجدنا أن تنخفض بشكل كبير في التفريق بين كل من الخلايا العصبية والخلايا العضلية عند المصنف الخلايا الأولية في البداية في مناطق ذات كثافة عالية جدا.
المظهري للتحليل ، وعادة ما تستخدم لوحات 384 جيدا لتنمو الخلايا الأولية للفحص أو تحليل التصوير بتكلفة أقل التكبير. لا يمكن أن يتحقق الصور مع التكبير أعلى من ذلك بكثير وافضل قرار من قبل خلايا المتزايد على شريحة من الزجاج غطاء غرفة ، تليها الخلايا إما مباشرة أو التصوير الملون باستخدام المجهر مبائر. ومعظم الخلايا الأولية هي ملتصقة ، يجب استخدام المنطقة للخلايا النمو في البئر من الشرائح غرفة كمبدأ توجيهي لتقدير كل من عدد الخلايا وكمية متوسطة المطلوبة لكل بئر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تطلى الشرائح غرفة تغطية الزجاج مع البروتينات خارج الخلية (ECM) مصفوفة مثل vitronectin الإنسان ، أو الرابع laminin الكولاجين للسماح للتمايز الخلايا الفائدة واحد. على سبيل المثال ، والعضلات الأساسية التفريق سيئة على زجاج الغطاء غير المطلي ، ولكن أيضا على زجاج الغطاء ECM المغلفة. أخيرا ، ينبغي الاستعاضة من أجل الحد من تألق ذاتي المنبعثة من المتوسطة والثقافة ، والثقافة المتوسطة العادية مثل الدرع وM3 سانغ ، مع العازلة يطير المالحة الفسيولوجية ، مثل HL6 ، والحق قبل التصوير.
من حيث المبدأ ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإعداد الخلايا الأولية من الذباب مع أي المورثات ، من مثل الاسهم متماثل متحولة قابلة للحياة وخصبة ، ومن أولئك الذين يمكن اختيار الأجنة يدويا أو بواسطة فارز على أساس التعبير عن GFP ، أو التعبير عن الأنسجة الخاصة Gal4 ، UAS الجينات المورثات X. بالاشتراك مع الأساليب الأخرى التجريب ، وسوف يسمح هذا البروتوكول إلى معالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة ، خصوصا تلك التي ترتبط إلى خلايا متباينة مثل الخلايا العصبية والعضلات ، ويصعب معالجتها في خطوط الخلايا المستزرعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
كان مدعوما من قبل JB ديمون رونيون زمالة مؤسسة أبحاث السرطان DRG - 1716-1702. وأيد JZ المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS زمالة GM082174 F32 - 02. NP هو محقق من معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
