Summary
我们提供一份详细的协议，准备原代细胞脱离
Abstract
在这里，我们描述了一个准备从果蝇原肠期胚胎和培养原代细胞分离的方法。总之，大量上演来自年轻和健康的苍蝇的胚胎收集，消毒，然后身体成单细胞悬浮液，使用玻璃匀浆分离。镀合适的密度，在培养基中培养板或玻片上后，这些细胞可以进一步分化成几种形态不同的细胞类型，可以通过其特定的细胞标记鉴定。此外，我们目前的治疗与双链（DS）的RNA这些细胞，引起基因敲除的条件。在果蝇中的主要细胞的高效RNAi是通过简单地沐浴在培养基中含有双链RNA的细胞。开展有效的RNAi的扰动，与其他分子生物学，生物化学，细胞成像分析的能力，将允许在果蝇的主要细胞，尤其是那些涉及到分化的肌肉和神经细胞的回答各种各样的问题。
Protocol
1。准备蝇笼
- 生长在方便的容器，如32盎司昆虫杯果蝇（野生型菌株，如俄勒冈- R或任何基因型）。
- 新eclosed苍蝇大的胚胎回收笼，或飞人口笼。
- 一个房间移动到笼子里的温度〜25 ° C，湿度〜65％在12小时轻和黑暗的12小时周期，以方便收集同步胚胎。
- 维持在笼子里的苍蝇喂养它们杀死酵母膏挑染糖蜜板。糖蜜板（死亡人数酵母膏）为2-3天更换一次D.
2。收集同步胚胎
- 在原细胞制备的一天，饲料苍蝇杀害酵母WTH新鲜涂层钢板为1-2 h前奠定期间粘贴。
- 就在12小时黑暗周期，更换新鲜糖蜜与少量的酵母膏挑染板前打下板。丢弃前打下的集合，它包含异步年纪较大的胚胎。
- 收集胚胎期为1-2小时。
- 5-6小时取出板含有胚胎和存储相对同步的人口在25 ° C胚胎将在先进的原肠胚阶段，在这个时候。
3。胚胎收集和洗涤
- 松开的胚胎，用湿画笔板块，并通过一个筛子叠不温不火的自来水彻底冲洗，使胚胎在底部收集最好的目筛。冲洗几分钟，以消除尽可能多的酵母和飞行碎片。
- 提示的筛子，使胚胎在一侧积累，并轻轻从筛洗成dechorionation筐。
- 移动到组织文化引擎盖区，而让胚胎干出。
4。同质化的胚胎和细胞电镀
- 他们沉浸在50％（体积/体积）5-10分钟漂白消毒和dechorionate胚胎。篮子的墙上用清水冲洗干净，用70％乙醇（体积/体积）的胚胎。另外，用蒸馏水洗净漂白乙醇治疗前关闭胚胎。从这一点起胚胎应在无菌条件下和在组织培养罩处理。
- 冲洗胚胎彻底灭菌蒸馏水中删除的漂白剂和/或乙醇。
- 在dechorionation步骤，填写一个Dounce匀浆，室温供应M3的介质的基础上，胚胎数量适当的音量。之间的胚胎数量和比例的媒体不应该超过0.5毫升胚胎：40毫升介质（或约100-200胚胎/毫升）。
- M3的媒体的数量足以淹没胚胎放置在灭菌烧杯冲洗胚胎。让胚胎浸泡2-5分钟。
- 拆开dechorionation篮子和印迹Nitex网状消毒纸巾擦干。
- 胚胎转移到均质，灭菌画笔。
- 均质轻轻短行程而深远的试管底部，直到所有的胚胎暂停使用一个松散的杵。然后轻轻地，但坚定地，同质化八分满招。杵为向上和向下移动，不要扭曲。
- 通过浇注或移液匀浆转移到无菌的50毫升锥形离心管，并帽管。
- 离心10分钟40G，室温组织碎片，大颗粒细胞团块和卵黄膜。转移上清到一个干净的管含有细胞和蛋黄和重复离心5分钟步。
- 小心地浇或360克在10分钟到一个干净的管和自旋吹打，室温颗粒细胞转移上清。上清液。悬浮在10毫升培养液中的细胞沉淀（RNAi实验的无血清培养基）。
- 使用血球估计细胞密度的活菌计数。同时，重复步骤4.10颗粒细胞。
- 悬浮细胞至所需浓度。要启动，请尝试范围是1〜5 × 10 6细胞/ ml和板在1.7至2.5 × 10 5细胞/厘米2。
5。在384孔板细胞生长的主要细胞的RNAi
- 免除到每口井在〜250纳克在384孔板，每孔终浓度为5μLdsRNAs。
- 使用多道移液器，免除每口井的主要细胞在无血清M3中型384板，包含在每口井的不同的双链RNA的10毫升（1〜4x106细胞/ ml）。此外，细胞可以培养8以及玻璃共焦成像玻片。
- 离心机板300G，室温1分钟。培养细胞无血清培养基在25 ° C为22小时或18 ° 1-2彗星D.
- 含血清培养基中加入30毫升，每口井。 离心机板300G，室温1分钟。
- 板放置在潮湿室和文化的主要细胞为额外的5〜7天在25 ° C。
- 图片的细胞免疫荧光染色后的活。
6。代表性的成果：
在最佳条件下，在文化的细胞看起来很健康的，圆的形态。文化将有小细胞碎片，并且50〜80％融合后初步电镀。这些细胞经过长时间培养后的形态学变化。它通常需要5-8天左右的文化细胞得到充分分化在25 ° C。优质的小学文化通常是判断细胞的利益如何在文化区别。例如，小学的肌肉细胞往往有分支状的形态，并成为与条纹状的肌系列组成的肌原纤维的多核肌管。完全分化的肌管通常会自发地在文化移动。相反，差异化的初级神经元形成的细胞体的集群，其轴突电缆连接与其他集群。
图1。主细胞进行形态学变化后，在文化镀
（A）原代细胞的明场像，后在384孔板以及镀。多数细胞是全面和完整，并很好地分离。 （B）原代细胞培养20小时后镀亮场图像。原代细胞已经形成集群（大箭头）的一个分支状的形态（长箭头），可以在此阶段的肌肉。 （三）一个小学文化的形象相衬，电镀后5天。看起来更先进的文化，与神经元扩展（小箭头），神经元簇（大箭头）和肌肉（中型箭头）。
图2。 dsRNAs治疗原发性细胞培养在384孔板
从账面Dmef2 - Gal4的胚胎，D42 - Gal4的，UAS的线粒体GFP转基因，其中Dmef2 - Gal4的D42 - Gal4的线粒体GFP的驱动器在肌肉和运动神经元的表达，分别为原代细胞中分离。针对要么lacZ基因（AC）或膨胀（如果）（DF）的dsRNAs细胞治疗。小学的肌肉和神经元可以看出，绿色荧光蛋白（A，C，D，F）。白色箭头指向神经扩展。鬼笔环肽染色显示肌动蛋白（箭头）在lacZ的dsRNAs（B和C）治疗文化的一个分支状的肌肉结构，但在文化的全面肌肉形态如果治疗dsRNAs（E和F）。在合并后的图像（C，F），肌肉都染成黄色，但红色的负面显示神经元及其扩展（白色箭头）。
图3。人类vitronectin涂盖玻片上培养的主要肌肉的共焦显微
主要肌肉immunofluorescently染色抗果蝇肌联蛋白（KZ）（红色）在合并和鬼笔环肽与肌动蛋白（在合并中的绿色）。顶部面板的野生型控制肌肉和底部的课后（CG31374）的RNAi缩短肌的肌肉。
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Discussion
果蝇细胞的原代培养的发展模式可以相差很大，可能是由于在主细胞制备过程中的几个变量。首先，苍蝇产卵应该是年轻的（在一个星期内老）和健康（无病毒或细菌感染）。未受精或受感染的胚胎必须避免，因为他们是无用的，从这些胚胎来源的细胞不能区分，将只能存活1-2天。其次，在同质化过程中，重要的是不超载太多的胚胎匀浆。匀浆超载太多的胚胎，会导致碎片和死细胞，最终会损害细胞的分化的数量金额的增加。最后，细胞应该是镀在适当的密度，以确保良好的原代细胞分化。我们发现，神经细胞和肌肉细胞的分化是大大降低了原代细胞接种密度过高，最初。
表型分析，384孔板通常用来种植筛选或成像分析的主要细胞在一个较低的放大倍率。以更高的放大倍率和更高的分辨率的图像可以实现上覆盖玻璃室幻灯片成像无论是生活或染色用共聚焦显微镜细胞生长的细胞。作为最首要的细胞贴壁，应使用面积生长的细胞在玻片以及细胞的数目和每口井需要中等量的估计准则。此外，可与细胞外基质（ECM）的蛋白质，如人类vitronectin涂层玻璃盖玻片，层粘连蛋白和Ⅳ型胶原，让利益细胞分化。例如，主肌肉非涂层覆盖玻璃上区分很差，但远ECM涂层覆盖玻璃。最后，以减少从培养基，如盾牌“和”桑供应M3的常规培养基，排放的自体荧光，应改为飞生理盐水缓冲液，如HL6前成像，。
本议定书的原则，可以用于制备原代细胞如任何可行和肥沃的纯合子突变股票的基因型，苍蝇和那些基于GFP表达了分选机，可以选择手动或胚胎，或表达组织特异性Gal4的，UAS基因X基因型。与其他试验方法相结合，该协议将允许要解决的各种问题，特别是那些与分化的细胞，如神经细胞和肌肉，并在培养细胞株难以解决。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
巴顿得到了达蒙Runyon癌症研究基金会奖学金DRG - 1716 - 02。锦州是支持由美国国立卫生研究院/ NIGMS奖学金F32 GM082174 - 02。 NP是霍华德休斯医学研究所研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
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