Summary
हम प्राथमिक कोशिकाओं की तैयारी से अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान
Abstract
यहाँ हम तैयारी और संवर्धन प्राथमिक कोशिकाओं ड्रोसोफिला गेसट्रुला भ्रूण से अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन. संक्षेप में, की एक बड़ी राशि युवा और स्वस्थ मक्खियों से भ्रूण मंचन एकत्र कर रहे हैं, निष्फल, और फिर शारीरिक रूप से एक गिलास homogenizer का उपयोग किसी एकल कक्ष निलंबन में dissociated. संस्कृति संस्कृति के माध्यम में एक उचित घनत्व या प्लेटें चैम्बर स्लाइड्स पर चढ़ाया जा रहा है के बाद, इन कोशिकाओं को आगे कई आकृति विज्ञान के अलग सेल प्रकार है, जो उनकी विशिष्ट सेल मार्कर के द्वारा पहचाना जा सकता है है में अंतर कर सकते हैं. इसके अलावा, हम डबल असहाय RNAs (डी एस) के साथ इन कोशिकाओं के इलाज के लिए जीन पछाड़ना प्रकाश में लाना करने के लिए शर्तों को प्रस्तुत करते हैं. ड्रोसोफिला प्राथमिक कोशिकाओं में कुशल आरएनएआई बस dsRNA युक्त मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं स्नान करके पूरा किया है. बाहर प्रभावी आरएनएआई गड़बड़ी ले, अन्य आणविक जैव रासायनिक, सेल इमेजिंग विश्लेषण के साथ एक साथ करने की क्षमता, ड्रोसोफिला प्राथमिक कोशिकाओं, विशेष रूप से विभेदित मांसपेशियों और neuronal कोशिकाओं से संबंधित उन में जवाब के लिए सवालों की एक किस्म की अनुमति देगा.
Protocol
1. मक्खी पिंजरों की तैयारी
- 32 ऑउंस कीट कप जैसे सुविधाजनक कंटेनर में ड्रोसोफिला (जैसे ओरेगन-R या किसी भी जीनोटाइप उपभेदों जंगली प्रकार) हो जाओ.
- बड़े भ्रूण संग्रह पिंजरों नव eclosed मक्खियों स्थानांतरण या जनसंख्या पिंजरों मक्खी.
- ~ 25 के एक तापमान के साथ एक कमरे में पिंजरों हटो डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता ~ 65% एक 12 घंटे प्रकाश में और एक काले 12 घंटे के चक्र के लिए तुल्यकालिक भ्रूण के संग्रह की सुविधा.
- खिला उन्हें खमीर गुड़ प्लेटों पर रेखादार पेस्ट को मार डाला द्वारा पिंजरों में मक्खियों बनाए रखें. 2-3 के लिए एक दिन में एक बार गुड़ प्लेट (मारे खमीर पेस्ट के साथ) बदलें मृ
2. तुल्यकालिक भ्रूण का संग्रह
- प्राथमिक सेल की तैयारी के दिन, मक्खियों wth ताजा मारे खमीर के साथ लेपित प्लेटें एक 1-2 घंटे पूर्व रखना अवधि के लिए पेस्ट फ़ीड.
- 12 घंटे अंधेरे चक्र बस से पहले, ताजा गुड़ खमीर पेस्ट की एक न्यूनतम राशि के साथ रेखादार प्लेटों के साथ पूर्व करना प्लेटों की जगह. पूर्व संग्रह करना है, जो अतुल्यकालिक पुराने भ्रूण को त्यागें.
- एच. 1-2 की अवधि के लिए भ्रूण लीजिए
- एच. 5-6 के लिए 25 में भ्रूण और दुकान के अपेक्षाकृत तुल्यकालिक जनसंख्या वाली प्लेटों ° सी निकालें भ्रूण उन्नत गेसट्रुला स्तर पर इस समय पर किया जाएगा.
3. संग्रह और भ्रूण की धुलाई
- एक गीला तूलिका के साथ प्लेटों से ढीला भ्रूण, और sieves की एक खड़ी सेट के माध्यम से गुनगुना पानी के नल के साथ अच्छी तरह कुल्ला करने के लिए, ताकि भ्रूण तल पर बेहतरीन जाल चलनी में जमा है. कुछ मिनट के लिए कुल्ला ज्यादा है और संभव के रूप में उड़ मलबे खमीर के रूप में निकालना.
- युक्ति इतनी sieves है कि भ्रूण को एक पक्ष में जमा है, और धीरे से उन्हें धोने चलनी से एक dechorionation टोकरी में बंद है.
- दे भ्रूण बाहर सूखी के बिना टिशू कल्चर डाकू क्षेत्र में ले जाएँ.
4. भ्रूण के homogenization और कक्षों की चढ़ाना
- जीवाणुरहित और उन्हें 50% (/ खंड खंड) 5-10 मिनट के लिए ब्लीच में डुबो कर भ्रूण dechorionate. 70 (/ खंड खंड)% इथेनॉल के साथ टोकरी की दीवार से भ्रूण कुल्ला. वैकल्पिक रूप से, आसुत जल के साथ भ्रूण बंद इथेनॉल उपचार से पहले धोने ब्लीच. इस बिंदु से आगे भ्रूण बाँझ परिस्थितियों में और टिशू कल्चर हुड में संभाला जाना चाहिए.
- भ्रूण अच्छी तरह कुल्ला autoclaved आसुत जल के साथ ब्लीच और / या इथेनॉल हटायें.
- Dechorionation कदम के दौरान, कमरे के तापमान एम 3 भ्रूण की राशि के आधार पर माध्यम की उचित मात्रा के साथ एक Dounce homogenizer भरने. भ्रूण की मात्रा और मीडिया के बीच अनुपात 0.5 मिलीलीटर भ्रूण से अधिक नहीं होना चाहिए: 40 मिलीलीटर मीडिया (या ~ 100-200 भ्रूण / एमएल).
- एम 3 मीडिया के लिए पर्याप्त राशि भ्रूण डूब के साथ एक निष्फल बीकर में rinsed भ्रूण रखें. भ्रूण 2-5 मिनट के लिए लेना.
- Dechorionation टोकरी जुदा और Nitex जाल निष्फल कागज तौलिये के साथ शुष्क दाग.
- Homogenizer में एक निष्फल तूलिका के साथ भ्रूण का स्थानांतरण.
- कम स्ट्रोक के साथ जब तक सभी भ्रूण को निलंबित कर रहे हैं ट्यूब के नीचे तक पहुँचने के बिना एक ढीला मूसल का उपयोग धीरे homogenize. फिर धीरे लेकिन दृढ़ता से, आठ पूर्ण स्ट्रोक के साथ homogenize. मूसल मोड़ के रूप में यह ऊपर और नीचे जाता मत करो.
- Homogenate या तो एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में डालने के लिये या pipetting द्वारा, स्थानांतरण और ट्यूब टोपी.
- 40g, कमरे गोली तापमान ऊतक मलबे, बड़े सेल clumps और vitelline झिल्ली पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला एक स्वच्छ ट्यूब कोशिकाओं और जर्दी युक्त और 5 मिनट के लिए centrifugation कदम दोहराने.
- डालने के लिये या 360g में एक स्वच्छ और 10 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन में pipetting, गोली के लिए कमरे के तापमान कोशिकाओं द्वारा ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend (आरएनएआई प्रयोगों के लिए सीरम मुक्त मध्यम).
- व्यवहार्य hemocytometer का उपयोग करने के लिए सेल घनत्व का अनुमान कोशिकाओं की गणना. इस बीच, गोली कोशिकाओं को 4.10 कदम दोहराने.
- एक वांछित एकाग्रता के लिए कोशिकाओं Resuspend. शुरू करने के लिए, 1 की एक सीमा ~ x10 5 6 कोशिकाओं / एमएल और 1,7 2,5 x10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी पर थाली बाहर की कोशिश.
5. 384 अच्छी तरह से थाली पर विकसित कोशिकाओं के लिए प्राथमिक सेल आरएनएआई
- ~ 384 अच्छी तरह से थाली में 250 एनजी के प्रति में अच्छी तरह से एक अंतिम एकाग्रता में एक कुएँ में dsRNAs के 5 μl बग़ैर.
- एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करें, 384 अच्छी तरह से प्रत्येक कुएं में एक अलग dsRNA युक्त थाली में एक सीरम मुक्त एम 3 मध्यम में अच्छी तरह से प्रति प्राथमिक कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर (1 ~ 4x106 कोशिकाओं / एमएल) बग़ैर. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं confocal इमेजिंग के लिए 8-अच्छी तरह से कांच चैम्बर स्लाइड पर संवर्धित किया जा सकता है है.
- 300g, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए प्लेटें अपकेंद्रित्र. संस्कृति सीरम मुक्त माध्यम में 25 में कोशिकाओं ° ° 22 घंटे के लिए या 18 की उम्र में सी सी 1-2 के लिए मृ
- सीरम युक्त संस्कृति के माध्यम के 30 मिलीलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें. 300g, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए प्लेटें अपकेंद्रित्र.
- एक नम कक्ष और संस्कृति के लिए एक अतिरिक्त 5 प्राथमिक कोशिकाओं 25 ~ 7 घ डिग्री सेल्सियस में प्लेटें प्लेस
- छवि कोशिकाओं या तो रहते हैं या immunofluorescence धुंधला के बाद.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
इष्टतम परिस्थितियों में, संस्कृति में कोशिकाओं के साथ एक दौर आकारिकी स्वस्थ दिखेगा. संस्कृति छोटे सेल मलबे, और प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 50 ~ 80% मिला हुआ हो. इन कोशिकाओं को किया जा रहा है समय की एक विस्तारित अवधि के लिए सुसंस्कृत के बाद morphological परिवर्तन से गुजरना होगा. यह 5-8 दिनों के बारे में आम तौर पर कोशिकाओं के लिए संस्कृति में पूरी तरह से 25 में विभेदित किया जा लेता डिग्री सेल्सियस अच्छी गुणवत्ता प्राथमिक संस्कृतियों आमतौर पर कैसे अच्छी तरह से कोशिकाओं की ब्याज संस्कृति में भेदभाव कर रहे हैं द्वारा न्याय कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं अक्सर एक शाखा की तरह आकारिकी है और myofibrils sarcomeres की एक श्रृंखला के निर्वाचकगण तरह पट्टी के साथ multinucleated myotubes बन. पूरी तरह से विभेदित myotubes आमतौर पर अनायास संस्कृति में कदम होगा. इसके विपरीत, विभेदित प्राथमिक न्यूरॉन्स अपने सेल शरीर के साथ समूहों के रूप में, और उनके अक्षतंतु केबल के साथ अन्य समूहों के साथ कनेक्ट.
चित्रा 1. प्राथमिक कोशिकाओं संस्कृति में चढ़ाया जा रहा है के बाद शब्द के भागों परिवर्तन से गुजरना
(ए) 384 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में चढ़ाया जा रहा है के बाद सही एक प्राथमिक कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवि. कोशिकाओं के बहुमत दौर और बरकरार है और अच्छी तरह से अलग हैं. (बी) प्राथमिक सेल संस्कृति का एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि 20 घंटे चढ़ाना के बाद. प्राथमिक कोशिकाओं को पहले से ही (बड़ा arrowhead) समूहों और एक शाखा की तरह आकारिकी (लंबे तीर) के साथ मांसपेशियों को इस स्तर पर पहचाना जा सकता है के रूप में. (सी) चढ़ाना 5 दिनों के बाद एक चरण विपरीत प्राथमिक संस्कृति की छवि. संस्कृति neuronal एक्सटेंशन (छोटे तीर), neuronal समूहों (बड़ा arrowheads) और मांसपेशियों (मध्यम आकार के तीर) के साथ और अधिक उन्नत लग रहा है.
चित्रा 2. 384 अच्छी तरह से एक थाली में सुसंस्कृत dsRNAs के साथ इलाज प्राथमिक कोशिकाओं के उदाहरण
प्राथमिक कोशिकाओं Dmef2 Gal4 ले जाने भ्रूण D42-Gal4, यूएएस Mito - GFP transgenes, जिसमें क्रमशः Dmef2 Gal4 और D42-Gal4 Mito - GFP की मांसपेशियों और मोटर न्यूरॉन्स में ड्राइव अभिव्यक्ति, से अलग थे. कोशिकाओं या तो (एसी) lacZ या फुलाया (यदि) (लोमो) लक्ष्यीकरण dsRNAs के साथ इलाज किया गया. दोनों प्राथमिक मांसपेशियों और न्यूरॉन्स GFP (ए, सी, डी, एफ) द्वारा देखा जा सकता है है. सफेद तीर neuronal एक्सटेंशन के लिए बिंदु. Actin (arrowheads) के Phalloidin धुंधला lacZ dsRNAs (बी और सी) के साथ इलाज संस्कृति में एक शाखा की तरह मांसपेशियों संरचना का पता चलता है, लेकिन राउंड - अप संस्कृति में मांसपेशियों आकारिकी अगर साथ इलाज किया dsRNAs (ई और एफ). मर्ज किए गए छवियों (सी, एफ) में, मांसपेशियों पीले दाग रहे हैं, लेकिन लाल नकारात्मक पता चलता है न्यूरॉन्स और उनके एक्सटेंशन (सफेद तीर).
चित्रा 3. प्राथमिक मांसपेशियों के Confocal micrographs सुसंस्कृत मानव vitronectin लेपित कवर गिलास स्लाइड पर
प्राथमिक मांसपेशियों immunofluorescently विरोधी ड्रोसोफिला Titin (KZ) (लाल मर्ज में) के साथ और actin के लिए phalloidin (मर्ज में हरा) के साथ दाग रहे थे. शीर्ष पैनल नियंत्रण जंगली प्रकार मांसपेशियों रहे हैं और नीचे वाले (CG31374) छोटा sarcomeres के साथ आरएनएआई मांसपेशियों sals हैं.
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Discussion
ड्रोसोफिला कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों के विकास पैटर्न काफी भिन्नता है, संभवतः प्राथमिक कोशिका तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान कई चर के कारण कर सकते हैं. सबसे पहले, अंडे बिछाने के लिए इस्तेमाल किया मक्खियों युवा (एक पुराने सप्ताह के भीतर) करना चाहिए और स्वस्थ (वायरल या जीवाणु संक्रमण से मुक्त). Unfertilized या संक्रमित भ्रूण से परहेज किया जाना चाहिए के रूप में वे बेकार हैं और उन भ्रूण से निकाली गई कोशिकाओं को अलग नहीं है और केवल 1-2 दिनों के लिए बच जाएगा कर सकते हैं. दूसरा, homogenization प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है भी कई भ्रूण के साथ homogenizer अधिभार नहीं है. भी कई भ्रूण के साथ homogenizer ओवरलोडिंग मलबे और मृत कोशिकाओं है, जो अंततः सेल भेदभाव समझौता की संख्या की राशि में वृद्धि का कारण होगा. अंत में, कोशिकाओं प्राथमिक कोशिकाओं के भेदभाव को सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त घनत्व पर चढ़ाया जाना चाहिए. हमने पाया है कि दोनों न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं के भेदभाव नाटकीय रूप से कम है जब प्राथमिक कोशिकाओं शुरू में एक भी उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त हैं.
प्ररूपी विश्लेषण के लिए, 384 अच्छी तरह प्लेटें आमतौर पर एक कम बढ़ाई स्क्रीनिंग या इमेजिंग विश्लेषण के लिए प्राथमिक कोशिकाओं के विकास के लिए उपयोग किया जाता है. एक बहुत उच्च बढ़ाई और बेहतर संकल्प के साथ छवियाँ एक कक्ष कवर गिलास स्लाइड, इमेजिंग या तो रहते हैं या दाग एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर कोशिकाओं द्वारा पीछा किया पर बढ़ती कोशिकाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. सबसे प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में अनुयायी हैं, चैम्बर स्लाइड्स के कुएं में बढ़ कोशिकाओं के लिए क्षेत्र के दोनों कक्षों की संख्या और प्रत्येक के लिए अच्छी तरह आवश्यक माध्यम की मात्रा के आकलन के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, कवर गिलास कक्ष स्लाइड्स ऐसे मानव vitronectin के रूप में में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है है, laminin या कोलेजन चतुर्थ कोशिकाओं के हित के भेदभाव की अनुमति के लिए. उदाहरण के लिए, प्राथमिक मांसपेशियों गैर लेपित कवर कांच पर खराब लेकिन ECM-लेपित कवर कांच पर अच्छी तरह से अंतर. अंत में, क्रम में करने के लिए मध्यम संस्कृति, नियमित रूप से संस्कृति शील्ड और गाया एम 3 जैसे माध्यम से उत्सर्जित autofluorescence कम एक मक्खी HL6 जैसे शारीरिक खारा बफर, इमेजिंग से पहले सही है, के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.
सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल जैसे homozygous व्यवहार्य और उपजाऊ उत्परिवर्ती शेयरों से किसी भी जीनोटाइप, के साथ मक्खियों से और उन भ्रूण जिनकी मैन्युअल रूप से चुना जा सकता है है या एक GFP की अभिव्यक्ति पर आधारित सॉर्टर द्वारा से प्राथमिक कोशिकाओं की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या व्यक्त ऊतक विशेष Gal4, यूएएस जीन एक्स जीनोटाइप. अन्य प्रयोग के तरीकों के साथ संयोजन में, इस प्रोटोकॉल सवालों की एक किस्म को संबोधित किया की अनुमति, विशेष रूप से उन है कि विभेदित कोशिकाओं को न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के रूप में में संबंधित हैं, और सभ्य सेल लाइनों में घेरने की कोशिश की जा मुश्किल है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
जेबी Damon Runyon कैंसर रिसर्च फाउंडेशन DRG-1716-02 फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. JZ / एनआईएच NIGMS - F32 GM082174 02 फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था. एनपी हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के एक अन्वेषक है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
