Summary
Forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule primarie dissociata dalla
Abstract
Qui si descrive un metodo per la preparazione e la coltura di cellule primarie dissociato da embrioni di Drosophila gastrula. In breve, una grande quantità di embrioni in scena dalle mosche giovani e sani sono raccolti, sterilizzati, e poi fisicamente dissociato in una sospensione singola cella utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Dopo essere stato placcato su piastre di coltura o le diapositive da camera alla densità adeguata nel terreno di coltura, queste cellule possono ulteriormente differenziarsi in diversi tipi di cellule-morfologicamente distinte, che possono essere identificati dal loro marker cellulari specifici. Inoltre, vi presentiamo le condizioni per il trattamento di queste cellule a doppia elica (ds) RNA a suscitare knockdown gene. RNAi in cellule di Drosophila efficiente primaria si ottiene semplicemente fare il bagno le cellule in dsRNA contenenti terreno di coltura. La capacità di effettuare efficaci perturbazione RNAi, insieme ad altri molecolare, biochimica, analisi di imaging cellulare, permetterà una serie di domande a cui rispondere in cellule di Drosophila primarie, in particolare quelli relativi alla muscolari differenziate e cellule neuronali.
Protocol
1. Preparazione di gabbie volare
- Crescono Drosophila (ceppi wild-type come Rimini-R o qualsiasi genotipo) in contenitori utili come 32-oz tazze insetti.
- Trasferimento di nuova eclosed vola a grandi embrio-raccolta gabbie o gabbie volare popolazione.
- Spostare le gabbie in una stanza con una temperatura di circa 25 ° C e umidità ~ 65% in una luce di 12 ore e una scura 12-h ciclo per facilitare la raccolta di embrioni sincrono.
- Mantenere le mosche nelle gabbie somministrando loro uccisi pasta lieviti striato su piatti melassa. Cambiare le piastre melassa (con pasta di lievito uccisi) una volta al giorno per 2-3 d.
2. Raccolta di embrioni sincrono
- Il giorno del primario a cellule preparazione, alimentazione le mosche wth piastre rivestite con lievito fresco ucciso pasta per un 1-2 ore di pre-laici periodo.
- Poco prima della 12-h ciclo scuro, sostituire le piastre pre laici con piastre di melassa fresca striato di una minima quantità di pasta di lievito. Eliminare la raccolta di pre laici, che contiene asincrono embrioni più vecchi.
- Raccogliere gli embrioni per un periodo di 1-2 h.
- Rimuovere le placche contenenti la popolazione relativamente sincrona degli embrioni e conservare a 25 ° C per 5-6 h. Embrioni saranno in fase avanzata gastrula in questo momento.
3. Raccolta e lavaggio di embrioni
- Allentare gli embrioni dalle piastre con un pennello bagnato e risciacquare abbondantemente con acqua corrente tiepida attraverso una serie di setacci impilati, in modo che gli embrioni raccolgono nel setaccio di maglia più in basso. Sciacquare per pochi minuti per rimuovere il lievito molto e detriti volare il più possibile.
- Suggerimento i setacci in modo che gli embrioni si accumulano da una parte, e delicatamente lavare al setaccio in un cesto dechorionation.
- Spostarsi nell'area cappuccio tessuto culturale senza lasciare che gli embrioni asciugarsi.
4. Omogeneizzazione di embrioni e di cellule placcatura
- Sterilizzare e dechorionate gli embrioni immergendole nel 50% (vol / vol) candeggina per 5-10 min. Risciacquare gli embrioni dal muro del paniere con il 70% (vol / vol) etanolo. In alternativa, lavare via la candeggina embrioni con acqua distillata prima del trattamento etanolo. Da questo punto in poi gli embrioni devono essere manipolati in condizioni sterili e nel cappuccio coltura di tessuti.
- Sciacquare gli embrioni a fondo per rimuovere la candeggina e / o etanolo in autoclave con acqua distillata.
- Durante la fase dechorionation, riempire un omogeneizzatore Dounce con il volume appropriato di medio M3 temperatura ambiente in base alla quantità di embrioni. Il rapporto tra il volume degli embrioni e quella dei mezzi di comunicazione non deve essere più embrioni di 0,5 ml: 40 ml media (o ~ 100-200 embrioni / ml).
- Mettere gli embrioni risciacquati in un bicchiere sterilizzato con la quantità di M3 mezzi sufficienti per immergere gli embrioni. Lasciate che gli embrioni ammollo per 2-5 min.
- Smontare il cestello dechorionation e macchia la maglia Nitex asciugare con salviette di carta sterilizzati.
- Trasferire gli embrioni in omogeneizzatore con un pennello sterilizzati.
- Omogeneizzare delicatamente con corse brevi utilizzando un pestello sciolto senza raggiungere il fondo del tubo fino a che tutti gli embrioni sono sospesi. Allora gentilmente, ma fermamente, omogeneizzare con otto colpi di piena. Non torcere il pestello come si muove su e giù.
- Trasferire l'omogeneizzato in una sterile da 50 ml provetta da centrifuga conica sia versando o pipettaggio, e il tappo del tubo.
- Centrifugare per 10 min a 40 g, temperatura ambiente per far sedimentare i detriti dei tessuti, ciuffi a grandi cellule e membrane vitellino. Trasferire il surnatante contenente le cellule e il tuorlo in una provetta pulita e ripetere la fase di centrifugazione per 5 minuti.
- Con attenzione trasferire il sopranatante versando o pipettaggio in una provetta pulita e spin per 10 minuti a 360g, temperatura ambiente per agglomerare le cellule. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura (mezzo privo di siero per esperimenti di RNAi).
- Conte cellule vitali mediante un emocitometro per stimare la densità cellulare. Nel frattempo, ripetere il passaggio 4,10 per agglomerare le cellule.
- Risospendere le cellule ad una concentrazione desiderata. Per iniziare, prova una gamma di 1 ~ 5 x10 6 cellule / ml e la piastra presso 1,7-2,5 x 10 5 cellule / cm 2.
5. Primario a cellule RNAi per le cellule coltivate su una piastra da 384 pozzetti
- Dispensare 5 ml di dsRNAs in tutti i pozzetti ad una concentrazione finale di circa 250 ng per pozzetto in una piastra da 384 pozzetti.
- Utilizzare una pipetta multicanale, dispensare 10 ml (1 ~ 4x106 cellule / ml) di pile per bene in un mezzo privo di siero in una M3 384 pozzetti contenenti un dsRNA diverso in ogni pozzetto. In alternativa, le cellule possono essere coltivate su vetrini da 8 pozzetti camera per l'imaging confocale.
- Centrifugare le piastre per 1 minuto a 300g, temperatura ambiente. Coltivare le cellule in mezzo privo di siero a 25 ° C per 22 h oppure a 18 ° C per 1-2 d.
- Aggiungere 30 ml di siero contenenti terreno di coltura in ciascun pozzetto. Centrifugare le piastre per 1 minuto a 300g, temperatura ambiente.
- Posizionare le piastre in camera umida e la cultura delle cellule primarie per altri 5 ~ 7 gg a 25 ° C.
- Immagine le cellule dal vivo o dopo la colorazione di immunofluorescenza.
6. Rappresentante dei risultati:
In condizioni ottimali, le cellule in cultura un aspetto sano con una morfologia rotonda. La cultura avrà poco detriti cellulari, e confluenti di 50 ~ 80% dopo la placcatura iniziale. Queste cellule subirà cambiamenti morfologici dopo essere stata colta per un lungo periodo di tempo. Di solito ci vogliono circa 5-8 giorni per le cellule in coltura di essere pienamente differenziate a 25 ° C. Culture di buona qualità primarie sono generalmente giudicati da come le cellule d'interesse sono differenziati in coltura. Per esempio, cellule muscolari primarie hanno spesso un ramo-come morfologia e diventare miotubi multinucleate con banda simile a miofibrille costituito da una serie di sarcomeri. Miotubi completamente differenziate di solito spontaneamente muoversi nella cultura. Al contrario, differenziato neuroni primari costituiscono cluster con i loro corpi cellulari, e connettersi con altri gruppi con i loro cavi assone.
Figura 1. Cellule primarie subiscono alterazioni morfologiche dopo essere stato placcato nella cultura
(A) Una immagine in campo chiaro di pile a destra dopo essere stato placcato in un pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. La maggior parte delle cellule sono rotondi e intatti e ben separati. (B) Un campo immagine luminosa di colture cellulari primarie 20 ore dopo placcatura. Cellule primarie già costituiscono cluster (grande punta di freccia) e muscoli con un ramo di tipo morfologico (freccia lunga) può essere riconosciuta in questa fase. (C) Un contrasto di fase immagine della cultura primaria 5 giorni dopo placcatura. La cultura sembra molto più avanzata, con estensioni neuronali (frecce piccole), ammassi neuronale (punte di freccia grande) e dei muscoli (medie freccia).
Figura 2. Esempi di pile trattate con dsRNAs colta in una piastra da 384 pozzetti
Cellule primarie sono state isolate dal embrioni aventi Dmef2-GAL4, D42-GAL4, UAS-mito-GFP transgeni, in cui Dmef2-GAL4 e D42-GAL4 espressione dell'unità mito-GFP nei muscoli e neuroni motori, rispettivamente. Le cellule sono state trattate con dsRNAs targeting per lacZ (CA) o gonfiato (se) (DF). Entrambi i muscoli primari e neuroni può essere visto da GFP (A, C, D, F). Le frecce bianche indicano le estensioni neuronali. Colorazione falloidina di actina (punte di freccia) rivela un ramo-come la struttura del muscolo nella cultura trattati con lacZ dsRNAs (B e C), ma retata morfologia muscolare nella cultura trattati con se dsRNAs (E e F). Nelle immagini fuse (C, F), i muscoli sono macchiate di giallo, rosso, ma i neuroni negativi spettacoli e le loro estensioni (frecce bianche).
Figura 3. Microscopio confocale dei muscoli primari coltivati su diapositive copertina umano vitronectina rivestita di vetro
Muscoli primari erano immunofluorescently colorati con anti-Drosophila Titin (KZ) (rosso in unione) e con falloidina di actina (verde nell'unione). I pannelli superiori sono le wild-type di controllo dei muscoli e quelle in basso sono i sals (CG31374) muscolo RNAi con sarcomeri accorciato.
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Discussion
Il modello di sviluppo di colture primarie di cellule di Drosophila può variare notevolmente, probabilmente a causa delle diverse variabili durante il processo di preparazione delle cellule primarie. Prima di tutto, vola per la posa delle uova devono essere giovani (entro una settimana di vita) e sano (privo di infezione virale o batterica). Embrioni non fecondati o infette devono essere evitati, in quanto sono inutili e le cellule derivate da questi embrioni non possono differenziare e potrà sopravvivere solo per 1-2 giorni. In secondo luogo, durante il processo di omogeneizzazione, è importante non sovraccaricare l'omogeneizzatore con embrioni di troppo. Sovraccaricare l'omogeneizzatore con embrioni troppi causerà un aumento della quantità di detriti e il numero di cellule morte, che finirà per compromettere la differenziazione cellulare. Infine, le cellule dovrebbero essere placcato ad una densità opportune per garantire una buona differenziazione di cellule primarie. Abbiamo scoperto che la differenziazione dei due neuroni e cellule muscolari si riduce drasticamente quando le cellule primarie sono seminate inizialmente a una densità troppo alta.
Per l'analisi fenotipica, piastre da 384 pozzetti di solito sono adibite alla coltivazione di cellule primarie di screening o di analisi di immagini con un ingrandimento minore. Le immagini con un ingrandimento molto maggiore e una migliore risoluzione può essere raggiunto dalle cellule che cresce su una copertura in vetro-camera di scorrimento, seguita da immagini sia cellule vive o tinto utilizzando un microscopio confocale. Come maggior parte delle cellule primarie sono aderenti, l'area per le cellule in crescita nel pozzo di diapositive camera deve essere utilizzato come linea guida per la stima sia del numero di cellule e la quantità di medio richiesto per ogni bene. Inoltre, la copertura in vetro camera di diapositive può essere rivestito con matrice extracellulare (ECM) proteine come vitronectina umano, laminina e collagene IV, per consentire la differenziazione delle cellule d'interesse. Per esempio, i muscoli primari differenziano poco sulla non-copertina rivestita di vetro, ma anche sulla ECM rivestite di copertura in vetro. Infine, allo scopo di ridurre autofluorescenza emessa da terreno di coltura, il terreno di coltura regolare come Shield e Sang M3, dovrebbe essere sostituita con una mosca tampone fisiologica salina, come HL6, poco prima di imaging.
In linea di principio, questo protocollo può essere utilizzato per la preparazione di cellule primarie dalle mosche con qualsiasi genotipi, ad esempio da omozigoti scorte fertile e vitale mutante, e da quelli in cui gli embrioni possono essere selezionate manualmente o con un sorter sulla base di espressione di GFP, o esprimere tessuto-specifica GAL4, UAS-gene X genotipi. In combinazione con metodi di sperimentazione, questo protocollo permette ad una serie di questioni da affrontare, specialmente quelli che sono legati a cellule differenziate come i neuroni e muscoli, e sono difficili da affrontare in linee cellulari in coltura.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
JB è stato sostenuto dal Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-02. JZ è stato sostenuto da NIH / NIGMS Fellowship GM082174 F32-02. NP è un investigatore del Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
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