Summary
Oligonucleotidi possono essere utilizzati per il sito specifico sostituire un singolo nucleotide dei geni bersaglio transfettate in entrambe le
Abstract
Parassiti Plasmodium, l'agente eziologico della malaria, sono trasmessi attraverso la puntura di zanzare anofele con conseguente oltre 250 milioni di nuove infezioni ogni anno. Nonostante decenni di ricerca, non esiste ancora un vaccino contro la malaria, evidenziando la necessità di strategie di controllo romanzo. Un approccio innovativo è l'uso di zanzare geneticamente modificati per il controllo dei parassiti in modo efficace la trasmissione della malaria. Alterazioni deliberate delle vie di segnalazione cellulare nella zanzara, tramite mutagenesi mirata, sono stati trovati a regolare parassita sviluppo 1. Da questi studi, possiamo cominciare a identificare gli obiettivi gene potenziale di trasformazione. Mutagenesi mirata è tradizionalmente invocata la ricombinazione omologa tra un gene target e una molecola di DNA di grandi dimensioni. Tuttavia, la costruzione e l'uso di tali molecole di DNA complesse per la generazione di linee cellulari stabilmente trasformate è costoso, richiede tempo e spesso inefficiente. Pertanto, utilizzando una strategia chiuso acido nucleico modificati oligonucleotidi (LNA-ons) fornisce una valida alternativa per l'introduzione artificiale sostituzioni di singoli nucleotidi in obiettivi DNA episomiale e cromosomiche gene (recensione in 2). LNA-ON-mediata mutagenesi previsioni è stato utilizzato per introdurre mutazioni puntiformi nei geni di interesse in cellule in coltura sia di lieviti e topi 3,4. Mostriamo qui che LNA-on può essere utilizzato per introdurre un cambiamento singolo nucleotide in un obiettivo transfettate episomiale che si traduce in un passaggio dal blu proteina fluorescente (BFP) espressione di proteina fluorescente verde (GFP) espressione in entrambe le Anopheles gambiae e Anopheles cellule stephensi . Questa conversione dimostra per la prima volta che la mutagenesi efficace di geni bersaglio in cellule di zanzara può essere mediata da LNA-on e suggerisce che questa tecnica può essere applicabile a mutagenesi di obiettivi cromosomiche in vitro e in vivo.
Protocol
- Prima di iniziare il protocollo, è importante stabilire che le cellule zanzara usati nell'esperimento sono sani e alla confluenza ~ 80% se aderente (Figura 1). Cellule ricoperte o insalubri si tradurrà in bassa efficienza di trasfezione e daranno risultati inconsistenti.
- Scaldare tutti i media prima di utilizzare in un bagno d'acqua ° 28 C per 30 minuti.
- A. stephensi MSQ43 cellule richiedono E5 medio: MEM, Earle w / glutammina, 5% FCS inattivato con il calore, lo 0,2% di D-glucosio, 1% di penicillina-streptomicina antibiotico, e 1% di aminoacidi non essenziali.
- A. gambiae cellule SUA5B richiedono S2 medio: Schneider Drosophila medium, 5% FCS inattivato con il calore, e 1% di penicillina-streptomicina antibiotico
- Scongelare e conservare tutti i materiali reagenti di trasfezione, plasmidi e oligonucleotidi su ghiaccio.
- Tutte le procedure devono essere effettuate in una cappa di coltura di tessuti con tecnica sterile.
- Per le cellule aderenti (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspirare fuori i vecchi media senza disturbare le cellule, aggiungere un volume equivalente di mezzi freschi che è stato riscaldato a 28 ° C, e poi risciacquare le cellule dal fondo della beuta con una pipetta.
- La concentrazione di cellule deve essere determinata e regolata per una concentrazione finale di 1x10 6 cellule / ml. Le celle possono essere conservati a temperatura ambiente durante la preparazione di materiali reagenti di trasfezione.
- Aggiungere 1 ml di cellule di zanzara (1x10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto di un 6-pozzetti. Impostare un piatto per ogni condizione sperimentale (vedi sotto).
Tabella I è un sistema di pipettaggio per una trasfezione generale. Tabella II illustra cinque condizioni per testare la mutagenesi di successo di un singolo nucleotide con BFP specifici LNA-ons. I primi due, pGFP e pBFP, sono controlli positivi e negativi, rispettivamente. I restanti sono le condizioni sperimentali di pBFPs con concentrazioni crescenti di BFP specifici LNA-ons. In passaggi da 8 a 12, aggiungere volumi adeguati di conseguenza per ogni reagente condizione. - Trasferimento di DNA plasmidico ad un tubo sterile 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere volume adeguato di tampone CE.
- Per 1 microlitri di DNA plasmidico (1 mg / mL), aggiungere 99 ml di tampone CE.
- Per 1 pGFP microlitri (1μg / mL), aggiungere 99 ml di tampone CE.
- Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL), aggiungere 99 ml di tampone CE.
- Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL) e 1 ml ON (mg / mL), aggiungere 98 ml di tampone CE.
- Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL) e 5 microlitri ON (1μg / mL), aggiungere 94 ml di tampone CE.
- Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL) e 10 L ON (1μg / mL), aggiungere 89 ml di tampone CE.
- Poi aggiungere lentamente Enhancer per 1 mg di DNA utilizzato.
- Per 1 microlitri di DNA plasmidico, aggiungere 8 microlitri Enhancer.
- Per 1 pGFP microlitri, aggiungere 8 microlitri Enhancer.
- Per 1 pBFP microlitri, aggiungere 8 microlitri Enhancer.
- Per 1 pBFP microlitri e 1 ml ON, aggiungere 16 microlitri Enhancer.
- Per 1 pBFP microlitri e 5 microlitri ON, aggiungere 48 microlitri Enhancer.
- Per 1 pBFP microlitri e 10 L su ON, aggiungere 88 microlitri Enhancer.
- Vortex DNA / buffer / Enhancer miscela per 1 sec e assicurarsi che tutta la soluzione è nella parte inferiore del tubo. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere il reagente Effectene per 1 mg di DNA plasmidico e vortex per 10 sec. Verificare che tutta la soluzione è in fondo del tubo e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Per 1 microlitri di DNA plasmidico, Effectene aggiungere 10 microlitri (Tabella I).
- Per 1 pGFP microlitri, Effectene aggiungere 10 microlitri (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri, Effectene aggiungere 10 microlitri (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri e 1 ml ON, Effectene aggiungere 20 microlitri (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri e 5 microlitri ON, aggiungere 60 microlitri Effectene (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri e 10 L su ON, aggiungere 110 microlitri Effectene (Tabella II).
- Portare ogni tubo ad un volume finale di 1000 ml con l'aggiunta dei media riscaldato goccia a goccia al DNA / buffer / Enhancer / Effectene miscela. DNA può precipitare a questo punto se il supporto è aggiunto troppo velocemente. Mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Per 1 microlitri di DNA plasmidico, aggiungere contenuti multimediali 882 microlitri (Tabella I).
- Per 1 pGFP microlitri, aggiungere contenuti multimediali microlitri 882 (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri, aggiungere contenuti multimediali microlitri 882 (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri e 1 ml ON, aggiungere 864 microlitri dei media (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri e 5 microlitri ON, aggiungere 792 microlitri dei media (Tabella II).
- Per 1 pBFP microlitri e 10 L su ON, aggiungere contenuti multimediali 702 microlitri (Tabella II).
- Prossimo aggiungere lentamente 1 mL di DNA appropriato / Enhancer / Effectene miscela in ciascun pozzetto una goccia alla volta.
- Agitare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e la miscela di trasfezione. Incubatcellule e in normali condizioni colturali.
- Un giorno dopo la transfezione, delicatamente aspirato fuori media e lentamente sostituire con un volume equivalente di media appena riscaldato. E 'importante non disturbare gli strati di cellule al fondo dei pozzetti durante questa operazione.
- Due giorni dopo la transfezione esaminare le cellule di controllo positivo transfettate con pGFP al microscopio a fluorescenza per determinare l'efficienza di trasfezione (Figura 2).
- SUA5B cellule crescono molto rapidamente e sarà invaso. Quattro giorni dopo la transfezione sottile queste cellule aspirando i vecchi media e aggiungendo lentamente un volume equivalente di media appena riscaldato.
- Dopo l'aggiunta di nuovi media per i pozzi, staccare tutte le cellule dal fondo di ogni bene pipeting su e giù, scartare la metà del volume (1 mL) della miscela di cellule e aggiungere 1 ml di fresca mezzi riscaldato per portare il volume finale a 2 mL.
- Controllare le cellule al giorno per assicurarsi che siano sani e non troppo lunghi, sottili, se necessario.
- Permettono alle cellule di crescere in condizioni normali per 5-7 dopo trasfezione giorni prima della loro raccolta per l'analisi.
- Alle 06:55 dopo trasfezione giorni, raccogliere le cellule aspirando i vecchi media in tutti i pozzi e l'aggiunta di 1 ml di PBS sterile a temperatura ambiente in ogni pozzetto.
- Staccare le cellule dal fondo del pozzo pipettando su e giù e il trasferimento miscela di cellule a 5 tubi ml tappo a scatto e subito analizzare le cellule mediante citometria a flusso.
Rappresentante Risultati
Figura 1. Untransfected A. sano stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B), le cellule a circa 80% confluenza.
Figura 2. A. stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B) cellule trasfettate con GFP controllo positivo che esprime plasmide.
Figura 3. Citometria a flusso di dati a conferma di conversione di BFP per GFP attraverso mutagenesi di un singolo nucleotide dopo trasfezione con BFP specifici bloccati acido nucleico modificati oligonucleotidi (LNA-ons). SUA5B cellule sono state transfettate con un plasmide che esprime GFP (pGFP) come controllo positivo, con un plasmide che esprime BFP (pBFP) come controllo negativo, o con pBFP e concentrazioni crescenti di BFP specifici LNA-ons. (A) strategia di gating per i dati di citometria a flusso che mostrano da sinistra a destra: scatter in avanti rispetto a lato di cellule vive, propidio ioduro (PI), le cellule negative, e le cellule GFP positive cinque giorni dopo la transfezione. (B) Grafico della percentuale di cellule GFP positive mostrato in (A) dopo trasfezione con pBFP e concentrazioni crescenti di LNA-ons.
Tabella I. Transfection condizioni.
Tabella II. Condizioni Transfection utilizzato nella Figura 1.
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Discussion
Qui vi presentiamo un metodo in vitro e prove per la conversione mirata di un singolo nucleotide in un gene bersaglio episomiale dopo la transfezione di LNA-ons in A. stephensi e A. gambiae cellule. LNA-ON-mediata conversione genica richiede l'induzione di un sito specifico per la risposta di riparazione del DNA, i nostri dati indicano che le cellule di zanzare in grado di supportare questo meccanismo di mutagenesi sito-specifici. Mentre il metodo qui presentato è basato sulla conversione di un obiettivo episomiale, i nostri dati suggeriscono che LNA-ON-mediata conversione può essere ottimizzato per obiettivi cromosomiche nelle cellule di zanzara, come è stato in altri sistemi. Conversione genica, quindi, faciliterebbe la creazione di linee di zanzara stabilmente trasformato cella senza protocolli complessi e lunghi regimi di selezione dei farmaci. Inoltre, la tecnologia esistente basato sull'uso di tag specifici mRNA fluorescente in cellule vive può essere sfruttato per ordinare ed arricchire le cellule zanzara convertito con obiettivi gene cromosomico per gli studi biologici 5-7.
Il successo di questo metodo dipende criticamente l'uso di cellule sane ad una densità di 70-80%. Inoltre, in tutte le fasi durante il processo di trasfezione è importante determinare che né il plasmide né LNA-ons sono precipitati dalla soluzione controllando visivamente la soluzione per precipitare. Una eventuale modifica di questo protocollo è quello di targa delle cellule 24 ore prima di iniziare il processo di trasfezione. Questo è consigliato per le linee di cellule crescita lenta o sensibili. Abbiamo trovato che il rapporto ottimale di DNA plasmidico di LNA-ons è stata 01:05 ma sarà importante per determinare il rapporto ideale per ogni nuovo gene e la linea cellulare di interesse.
Una serie di studi hanno identificato loci zanzara e geni che conferiscono resistenza a 8-10 parassita della malaria infezione. Se questi obiettivi sono suscettibili di manipolazione - attraverso il miglioramento della tempistica o il reindirizzamento di espressione - possono fornire una base per l'ingegneria genetica come strategia per il controllo dei parassiti trasmissione della malaria in popolazioni di vettori naturali. La metodologia qui discussi è una tecnica innovativa ed efficace per l'introduzione di mutazioni in geni di resistenza della malaria in laboratorio. Attraverso queste manipolazioni dei geni di interesse, possiamo determinare in modo specifico come prodotti genici alter cellulari anti-parassita risposte in vitro, un passo fondamentale per controllare la comprensione dello sviluppo dei parassiti della malaria in vivo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Abbie Spinner presso il Centro nazionale di ricerca sui primati della California per la sua assistenza con citometria a flusso. Questo studio è stato sostenuto da un finanziamento dell'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 e AI078183.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
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