Summary
거대한 섬유 시스템은 성인의 간단한 회로의 연결입니다
Abstract
성인 놀라게하는 경우 D. melanogaster은 공중으로 점프하고 멀리 비행 반응. D. 등 많은 무척추 동물에서 성인 단계에서 melanogaster, "탈출"(또는 "놀라게") 응답은 여러 구성 요소의 연결 회로 거대한 섬유 시스템 (GFS)라고하여 중재합니다. 뉴런, 그들 특유의 형태학 및 간단한 연결의 비교 대형 크기는 GFS의 연결 회로를 공부에 대한 매력적인 모델 시스템을 확인합니다. GFS의 경로는 그의 axons 자궁 결합을 통해 흉부 신경절에 정중선을 따라 머리에서 내려와이 양자 대칭 장 섬유 (GF) interneurons 구성되어 있습니다. 복부 신경 tergotrochanteral 근육 드라이브 ipsilateral motorneuron 1) 큰 중간 dendrite (TTMn) (TTM), mesothoracic 대퇴골 / 다리의 주요 신근와 GFS 양식 전기 화학 시냅스의 mesothoracic neuromere (T2)에서 하고, 2) contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) 어느 방향 양식에있는 등 지느러미 근육 길이 (DLMs)의 motorneurons (DLMns), 날개 depressors과 화학 (cholinergic) 시냅스. 그들은 날개에 직접 연결된 것이 아니라 이동하지 않습니다 - dorsovental 근육 (DVMs)으로의 연결 통로 (S), 날개 엘리베이터 아직 (DLMs와 DVMs가 간접 비행 근육으로 공동으로 알려져 있습니다 풀려되지 않았습니다 간접적으로 왜곡된 인근 흉부 표피에 의해 날개) (왕의 와이먼, 1980;. 앨런 외, 2006). DLMs의 디 - 시냅스 활성 (PSI를 통해)는 TTMs 먼저 대퇴골을 연장하여 추진 수 TTM의 monosynaptic 활성화 (~ 0.5 MS)에 상대 이러한 근육의 수축의 타이밍에 작지만 중요한 지연을 초래 지상에서 비행. 동시에 차례로 서로 비행 기간 동안 DVMs을 신장 활성화 DLMs을 스트레칭 활성화 TTMs. GF 경로는 감각 (예 : "공기 퐁퐁"또는 "라이트 - 오프") 자극을 적용하여 중 간접적으로 활성화하거나 직접 두뇌 (여기서 설명)에 위에 - 임계값 전기 자극에 의해 수 있습니다. TTMns 및 DLMns 다른, 밝혀지지 않은, 감각 입력을하더라도 두 경우 모두에서, 행동의 가능성은 전적으로 GFS, PSIs 및 TTM / DLM motoneurons 통해 TTMs 및 DLMs 도달합니다. "지연 반응"(자극과 근육의 탈분극 사이의 시간)과 측정 (고주파 자극의 특정 숫자로 성공적인 응답의 숫자) "고주파 자극에 다음과 같은 것은"reproducibly 및 양적 기능 상태를 평가하는 방법을 제공한다 모두 중앙 시냅스 (GF - TTMn, GF - PSI, PSI - DLMn) 및 화학 (glutamatergic) 신경근육학 분기점 (TTMn - TTM 및 DLMn - DLM)을 포함하여 GFS 구성 요소의. 이것은 중앙 버렸네 형성에 관련된 유전자를 식별하고 CNS 기능을 평가하기 위해 사용되고 있습니다.
Protocol
1. 장비 및 재료
- 이러한 실험 자극기, 자극 격리 장치 두 microelectrode 앰프, 데이터 수집 시스템 및 수집 소프트웨어를 컴퓨터로 구성된 표준 전기 생리학 설정을 사용합니다. 추가 장비는 패러데이 케이지, 붐 스탠드에 stereomicroscope, 진동 절연 테이블, 광원 및 녹음 플랫폼을 포함합니다.
- 다섯 micromanipulators이 사용됩니다. 다른 세 micromanipulators는 두 자극 전극과 접지 전극을 위치로 총 컨트롤을 필요로하는 동안 두 micromanipulators은 기록 전극을 위치에 대한 미세 제어를 필요로합니다. DLM 기록 전극에 대한 micromanipulator은 준비의 꼬리 끝에 배치됩니다 (실험자의 왼쪽)과 TTM 기록 전극에 대한 micromanipulator은 준비의 실험자와 사이드 (약간 실험자의 왼쪽에있는) 사이에 배치됩니다. 시뮬레이션 전극을 개최합니다 두 micromanipulators은 준비의 머리 (오른쪽 실험자의)에 배치됩니다. 접지 전극에 대한 micromanipulator은 준비의 반대편에 위치
- MΩ 40-60의 resistances와 유리 녹음 microelectrodes를 당기면 왁스 지원 접시에 평평하게 보관합니다. 자극에 대한 두 electrolytically (NaOH) 둘레에 텅스텐 전극이 사용됩니다. 텅스텐 와이어, 나 다른 공급 electrolytically 가공 전극은 접지로 사용됩니다. 자극 및 접지 전극은 준비하고 micromanipulators에 연결된 실험 세션의 시작하기 전에 및 세션의 기간 동안 교체하지 않아도됩니다.
2. D. 준비 melanogaster
- 장비가 설정되면, 그것은 파리를 준비하는 시간이야. 그들에 얼음을 냉각하거나 CO 2를 사용하여 파리를 마취. CO 2를 사용하는 경우 다음 실험을 시작하기 전에 깨어나기 가스의 효과에 대한 충분한 시간을 (20mins에 대해) 수 있습니다.
- 약 45 °의 각도로 sloped 소프트 왁스의 플랫폼을 포함하는 요리 자신의 다리로 부드럽게 파리를 전송하는 집게를 사용하십시오. 다음 4 단계 (하지만 주변) 녹음 장비 멀리 해부 현미경으로 이루어집니다.
- 다음 단계는 왁스의 비행을 확보하는 것입니다. 경사면의 앞쪽에 직면 위쪽과 아래쪽 동양의 파리 복부 측면. 좋은 포셉 한 켤레를 사용하면, 쌍, 다리의 바깥쪽을 연장하고, 밀랍으로 그들을 밀어.
- 지느러미 세로 근육이나 DLM 및 tergotrochanteral 근육, 또는 TTM :에서 기록하는 근육의 위치를 맡은지. DLMs의 subcuticular 첨부 파일 사이트는 흉부 정중선과 앞쪽에 지느러미 (또는 setae) bristles 사이의 영역과 일치합니다. TTM 첨부 파일 사이트는 뒷부분과 앞쪽에 위에 - 날개가 bristles의 dorsally 있습니다. 날개, DLM 또는 TTM 섬유에 대한 액세스를 방해 바깥쪽 날개를 잡고 '접착제'그들 왁스로되지 않도록 제작.
- 포셉의 벌금 쌍을 사용하여 바깥쪽으로 조심스럽게 코를 끌어와 밀랍으로 그것을 immersing하여 보안. 이것은 코가 부드럽고 쉽게 머리의 나머지 부분에서 분리되기 때문에 연습을 요구하는 중요한 단계입니다. 그렇게되면, 파리를 버리고 다시 시작. 눈을 통해 자극 전극을 삽입 때이 방법으로 머리를 보호하지 않으면 문제가 발생합니다.
3. 전극 배치
- 비행이 왁스로 고정되면, 패러데이 케이지 안에있는 stereomicroscope 아래 첨부된 플라이로 요리를 전송합니다. 동양은 실험자의 오른쪽에있는 비행의 머리를 옆으로 날아.
- 다음 단계는 전극을 삽입하는 것입니다. 지상과 자극 전극은 현미경으로 보지 않고 삽입하실 수 있습니다. 좋은 음반은 정확한 뽑에 의존, 그것은 micromanipulators 처리 연습하는 것이 좋습니다 그럼. 자신의 적절한 배치와 후속 녹음을 촉진하기 위하여 micromanipulators의 도움으로 삽입의 사이트에 가까운 전극을 가져와.
- micromanipulator에 조정 바퀴를 사용하여 복부의 뒷부분 끝에 접지 전극을 낮추십시오. 두뇌에 날카롭게 자극 텅스텐 전극을 삽입하려면 그냥 파리의 눈 중 하나를 만지는 때문에 전극 중 하나의 팁을 위치로 micromanipulator를 사용합니다. 두 전극 막 각 눈의 바깥쪽을 건드리는거야 그래서 다른과 동일한 작업을 수행. 다음 전극을 눌러, 차례로 각각의 눈을 통해 전극의 도움말을 머리 캡슐의 뒷면 (2-3밀리미터 정도)에 위치한 두뇌를 도달.
- 올바르게 배치 전극은 거대한 섬유 시스템을 활성화합니다. 자극 전극이 올바르게 배치되었는지 테스트하려면, 30-60의 짧은 (0.03 MS) 자극을 적용자극 전극, 그리고 비행 / 다리 근육의 날개 기라도의 움직임을 찾아 건너 V '
- 다음 단계는 해밀턴 또는 열을 뽑아 플라스틱 주사기를 사용하는 3M KCl과 유리 microelectrodes 다시 - 작성 및 미세 제어 micromanipulators에 그들을 배치하는 것입니다. 제대로 삽입 microelectrodes는 실험의 여러 라운드에 사용될 수 있습니다.
- 첫번째 기록 전극은 DLM 섬유에 삽입됩니다. 이 양자 대칭 DLMs가있다, 각 6 각 근육 섬유로 구성되어 있습니다. 녹음은 여섯 섬유의에서 수행할 수 있지만, 가장 일반적으로 사용되는 DLM 섬유 흉부 표피의 지느러미 측면을 통해 좋은 접근으로 인해 45A 및 45B, 그리고 두 섬유가 같은 motorneuron에 의해 innervated있다는 사실 아르 .
- 당신에게서 멀리 떨어져 측면에 micromanipulator를 사용하여, DLM 섬유 45A 또는 B.에 기록 전극을 삽입 플랫폼의 경사가 DLM 전극 삽입을 에이즈 ~ 60-90 각도에서 지느러미 표피를 입력할 수 있습니다. 오실로 스코프 모드에서 소프트웨어를 사용하여 흉부에 기록 전극을 삽입하는 동안 컴퓨터 모니터보세요. 전극은 근육을 입력했을 때 기준이 근처 제로 또는 마이너스 값을 드롭합니다. 당신은 근육 반응을 관찰할 수 있는지에 대한 하나의 자극과 함께 테스트합니다.
- 당신에게 가장 가까운 TTM에 다른 기록 전극을 삽입합니다. 이 전극은 근육 첨부 파일 사이트의 위치로 인해, 당신의 앞에, 옆으로 삽입됩니다. 추적은 전극이 근육에 표시되면 하나의 자극이하고 테스트를하는 동안 다시 모니터를 관찰합니다.
4. 자극 및 녹음
- 이제 다리와 비행 근육에서 두뇌와 녹음 답변을 자극 시작할 준비가 된 것입니다. (컴퓨터 모니터에 관찰로 즉 근육 트위치, 그리고 근육 세포 탈분극)는 응답을 관찰하기 전까지 30 V에서 시작 60 V로 증가 자극 전극에 걸쳐 짧은 (0.03 MS) 자극을 적용합니다. 실험의 나머지 부분은 응답 임계값 위의 전압 5-10 V를 설정합니다.
- 응답 지연 시간을 측정하려면 각 자극 사이에 오초 휴식 기간 최소 5 단일 자극을 제공합니다.
- 서로 다른 속도로 자극의 기차를 제공하여 "다음 중 주파수"를 확인합니다. 일반적으로 열 자극 10 열차는 200Hz (각 자극 사이 5ms)와 300Hz는 (각 자극 사이 3ms), 100Hz (각 자극 사이 10ms)에 부여됩니다. 자극의 각 열차 사이 이초의 휴식 기간을 허용합니다.
5. 결과 : 거대한 섬유 패스에 다음과 같은 응답 대기 시간 및 빈도
- 응답 지연 시간은 두뇌의 자극과 근육의 탈분극 사이의 시간입니다. 이 그림은 하나의 자극에 DLM과 TTM에 대한 응답 대기 시간을 비교합니다. 0.7 및 GF - DLM 경로에 대한 GF - TTM 경로 및 1.3 1.7 MS 사이에 1.2 MS 사이의 대기 시간은 건강한 준비와 적절한 레코딩 기술을 나타냅니다. 대기는 유전자형, 유전자 배경, 온도와 나이가 다를 수 있습니다.
두뇌에 적용되는 하나의 자극 아래 TTMs과 DLMs에서 기록된 응답을 보여주는 그림 1 (A와 B). 대표 흔적. - 여기로 표시된 TTM에서 녹음 진폭과 대형 DLM 섬유의 사람들에게 비해 postsynaptic 잠재적인 (PSP)의 형태 측면에서 많은 변화를 보여,이 증가 변화는 TTM 근육 섬유의 작은 크기로 인해합니다. 이 변화는 그러나, 거대한 섬유 - 투 - TTM 경로에 대한 응답 지연 값에 영향을주지 않습니다.
TTM와 DLM 모두 4 개인 파리에서 그림 1 (C와 D). 자세한 '응답 지연 시간'흔적. PSP 모양의 TTM의 흔적 전시 변화 참고하지만, 응답 지연 시간은 영향을받지 않습니다. DLM을위한 PSP 모양의 적은 변화가 있습니다.
- 각각의 자극 주파수에서 DLM과 TTM 경로 모두에 대해 성공적인 응답 (10 밖으로)의 비율을 계산하여 100 Hz에서 200 Hz에서, 300 Hz에서에서 "다음 중 주파수"를 비교합니다. 100 Hz에서에서 TTM과 DLM 모두 자극 1시 1분를 따르십시오. 이 interneurons 사이의 중간 화학 버렸네가 자극 사이에 복구할 수있는 충분한 시간이 없기 때문에 100 Hz에서 위의 자극 주파수에서 DLM 응답은 오류를 표시 시작합니다. TTM 답변 그러나, 심지어는 300Hz 이상의 자극과 1시 1분 남아 있습니다.
그림 2. 녹음 "다음 중 주파수"를 보여주는 대표 흔적. 100Hz에서 모두 TTMs 및 DLMs 모든 열 자극 (왼쪽)에 대응. 200Hz에서 DLM 응답은 (별표) 실패 시작합니다.
6. 대표 결과
와일드 타입 짧은 대기 시간 반응 (자극 전극은 감각 수용체를 무시하고 직접 GF 회로를 실행, 눈 상태에 놓이게됩니다) 0.7 및 GF - TTM 경로에 대한 1.2 MS 사이 유전자형, 유전자 배경, 온도 및 연령 및 범위에 따라 GF - DLM 경로에 대해 1.3 and1.7 MS (Tanouye 및 와이먼, 1980, 토마스 및 와이먼, 1984, 엥겔 및 우, 1992, 알렌과 머피, 2007; 펠란 외, 2008;. 오거 스틴 외, 게시되지 않은.) . 이것은 매우 짧은 TTM 지연 때문에 경로의 disynaptic 자연뿐만 아니라 화학 버렸네 (PSI - DLMn)의 존재의 monosynaptic 경로와 긴 대기 시간 DLM의 강력한 GF - TTMn 전기 버렸네 때문입니다 발생합니다. GF의 afferents의 활성화와 낮은 강도 자극을 사용하거나 시각 ( "빛을 해제") 신호를 제공함으로써 중 달성 아르에서 중급 및 장기 지연 반응 (> 3 MS) 결과. 100Hz에서 TTM과 DLM 모두 자극 1시 1분을 따라야합니다. 100Hz 위 DLM 응답은 PSI와 DLMns 사이의 화학 버렸네가 떨어져 10ms 미만의 자극 사이에 복구하는 충분한 시간을 없다처럼 실패를 표시하기 시작합니다. TTM 응답 그러나, 심지어는 300Hz (; 엥겔 및 우, 1992;. 앨런 외, 2007;. 마르티네즈 외, 2007 Tanouye 및 와이먼, 1980) 이상의 자극과 1시 1분 유지됩니다. GF - DLM 분기 응답하는 동안 Drosophila 간격 교차로 채널 ( "innexin")를 인코딩 shakB 유전자에 돌연변이, 크게 GF - TTM 경로 (~ 1.5 MS)의 응답 대기 시간을 증가 (알렌과 머피, 2007; 펠란 외., 2008). 돌연변이 응답이 지연 효과가 중단 신경근육학 전송으로 인해 아니라는 것을 보여주는 직접 흉부 신경을 자극하여 복원할 수 있습니다. 고주파 자극을 수행하는 능력 또한 야생 입력 GF - DLM 및 GF - TTM 경로는 보통 각각 100 Hz에서 300 Hz에서에 1시 1분 비율 10 자극을 수행하실 수 있습니다 어디에 파리에 비해 이러한 mutants에서 장애인입니다. 이러한 주파수는 상당히 지속적인 비행 (30-10 Hz에서) (Hummon와 코스텔로, 1989) 동안 계약 근육에 의해받은 정상적인 자극 주파수 위에됩니다하는 것이 중요합니다.
GFS 출력의 안정성을 설명하는 데 사용되는 다른 매개 변수는 "불응기"또는 아직도 근육 두 응답을 생산 트윈 자극 펄스 사이의 최소 시간입니다. 내화 시간 TTMs 및 DLMs에 대한 7-15 MS에 대해 1-4 사이의 MS를 따라 다릅니다. DLMs에 대한 비교적 긴 내화물 기간은 상대적으로 PSI - DLMn 접합 (Tanouye 및 와이먼, 1980에서 화학 시냅스를 불안 정한 예정이다, Gorczyca 및 홀, 1984, 엥겔 및 우, 1992; 바너지 외, 2004;. 앨런과 Godenschwege, 2010).
Discussion
하나는 고품질의 녹음을 얻을하려고 할 때주의를 지불했다 가장 중요한 것들 중 하나는 준비의 적절한 오리 엔테이션과 건강입니다. 이상적으로, 파리는 여전히 전기 자극에 반응하는 레코딩 세션의 끝에 살아하고해야합니다. 에 기록 전극이 가장 효율적으로 흉부 외골격을 뚫고위한 전극과 직각을 이루는 등, 즉시 그러한 방식으로 표면에 붙어 있어야, 필요한 경우, 전극의 삽입은의 일부를 제거하여 용이 될 수있다 메스 텅스텐과 지느러미 흉부 표피 따라서 DLM 비행 근육 (이 단계는 어렵게 유리 전극의 도움말을 휴식하는 만들기의 추가 혜택을 제공합니다) 노출. 또한, 치료가 subcuticularly 위치 DLMs 및 TTMs을 통해 전극을 밀어 피하기 위해 이동해야합니다. 파리의 머리는 잘 제대로 두뇌에 삽입되도록 자극 전극 수 있도록하고이 레코딩 세션 동안 꺼내되는 것을 방지하기 위해 보안해야합니다.
의 크기와 잘 설명하는 형태로 인해 GFS는 Drosophila에서 가장 접근의 연결 경로 중 하나를 나타냅니다. 작은 분자량의 추적 염료로 전기 시냅스의 투자율은 전기 결합 뉴런의 시각화를위한 수 있으며, 여러 가능한 GAL4 라인은 가능한 셀 또는 셀 그룹 (제이콥스 외, 2000의 일부에서 유전자 발현 수준을 조작하게;. 앨런 외., 2006) Drosophila GFS의 연결을 소성을 공부에 편리한 모델 시스템 (엥겔 및 우 만들기 위에서 언급한 장점, 그러한 요법 이니, 자발적인 복구 및 dishabituation로 회로 디스플레이 등록 정보의 모두 수입 성의와 흉부 구성 요소 이외에도, 1996).
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 LP로 웰컴 트러스트 부여에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S48 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | ||
| Stimulation unit | Grass Technologies | ||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies | ||
| 5A two-channel intracellular Micr–lectrode Amplifier | Getting Instruments, Inc. | ||
| Digidata 1440A data acquisition system | Molecular Devices | ||
| Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software | Molecular Devices | ||
| Recording platform with manual micromanipulators | Narishige International | ||
| Light source | Fostec | ||
| Wild M5 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| Borosilicate tubing for micr–lectrodes | Sutter Instrument Co. | ||
| P-95 Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | |
| Microdissection tools (forceps,…) | Fine Science Tools | ||
| Dissecting (stereo) microscope | Leica Microsystems | ||
| Faraday cage | Unknown | ||
| Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor... | |||
References
- Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).
- Banerjee, S., Lee, J. Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila. J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).
- Engel, J. E., Wu, C. F. Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila. J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).
- Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
- Hummon, M. R., Costello, W. J. Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers. J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).
- Jacobs, K., Todman, M. G. Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target. Development. 127, 5203-5212 (2000).
- King, D. G., Wyman, R. J. Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway. J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).
- Martinez, V. G., Javadi, C. S. Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila. Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).
- Phelan, P., Goulding, L. A. Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system. Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).
- Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J Neurosci. 4, 530-538 (1984).
