我们介绍了用于构建和运行一种可重现异质性肿瘤微环境的微流控装置的实验流程 体外采用荧光染色法对肿瘤组织内细胞凋亡的变异性进行定量分析，并评估化疗药物阿霉素在肿瘤组织中的有效扩散系数。
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本文内容
摘要
摘要
我们开发了一种微流控装置，可模拟药物向体外三维异质性肿瘤组织的递送及其系统性清除过程。由脉管系统输送的营养物质无法到达肿瘤的所有区域，从而形成了包含存活细胞、静止细胞和坏死细胞等多种细胞类型的异质性微环境。由于这种异质性，许多抗癌药物难以有效渗透并治疗所有类型的细胞。癌细胞的单层培养模型无法模拟这种异质性，使得在合适的体外模型中测试抗癌药物变得困难。我们的微流控装置采用软光刻技术以PDMS材料加工而成。通过悬滴法形成的多细胞肿瘤球体被插入装置上的矩形腔室中，并在一侧通过持续灌注培养基加以维持。装置上腔室的矩形结构在组织内建立了线性梯度。利用荧光染料对组织内凋亡的异质性进行定量分析。装置上的肿瘤模型用荧光化疗药物阿霉素（doxorubicin）处理，并通过延时显微镜监测药物在组织中的扩散过程，进而估算其有效扩散系数。悬滴法可快速从多种癌细胞系形成均一的球体。该装置支持球体生长达3天之久。靠近流动培养基的细胞凋亡程度较低，而远离通道的细胞则表现出更高的凋亡水平，从而准确模拟了肿瘤中邻近血管区域的微环境特征。所估算的阿霉素扩散系数与既往报道的人类乳腺癌中的数值一致。鉴于药物在实体瘤中的渗透与滞留情况直接影响其疗效，我们认为该装置是研究药物行为及开发新型抗癌疗法的重要工具。
方案
1. 器件制备
弹性体材料中微流控结构的复制基于Duffy等人1所描述的方法。
- 按9:1的质量比混合硅弹性体试剂盒（Dow Corning，Midland, MI）中的弹性体（聚二甲基硅氧烷；PDMS）和固化剂，浇注于母模上形成4 mm厚的层。脱气以去除气泡，并在60°C下固化5小时。将固化的PDMS从模具上剥离，得到具有流道结构的弹性体印章。
- 使用安装在台钻上的1.5 mm活检打孔器（Miltex，York, PA）在进样口和出样口位置打孔。清除残留碎屑。
- 将印章的结构面和洁净的玻璃载片置于氧气等离子体刻蚀仪中进行8分钟的氧气等离子体处理。立即使处理后的表面相互接触，以形成键合。将组装件置于载片加热器上，在60°C下保持至少5小时，以增强键合强度。
- 使用连接在带凸齿的雌性鲁尔锁接头（Qosina，Edgewood, NY）上的雄性鲁尔锁接头，将内径为0.032"的PTFE管（Cole Parmer，Vernon Hills, IL）连接至进样口和出样口。
- 使用关闭阀和Y型连接器（Upchurch Scientific，Oak Harbor, WA；图1）搭建流动装置。将装置固定在显微镜上。使用20G 1.5"针头（BD Bioscience，R....
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讨论
肿瘤中的血管系统稀疏且发育不良7,8。存在一些距离血管较远（>100 μm）的区域，无法通过血管系统获得营养物质和药物9。这种异质性微环境导致许多化疗药物的疗效受限10。本文开发的微流控装置在体外重现了具有增殖、静止以及凋亡或坏死细胞特征的异质性肿瘤微环境。靠近通道的细胞保持活性，但因扩散受限，在远离通道的区域形成营养缺乏并导致细胞凋亡。该流动通道模拟血管，而球形结构则代表肿瘤内邻近血管的一个小区域。
在将类球体引入装置时，需确保打孔的入口干净且无碎屑，因为任何对组织流动的阻碍都可能导致腔室填充失败或类球体断裂。在引入类球体的过程中，装填注射器需手动操作。流速必须尽可能保持最低，以避免将类球体推过腔室后方的支柱。与所有微流控装置一样，在操作过程中必须采取一定措施以避免系统中产生气泡，尤其是在更换注射器时。每次更换注射器时剪去一小段管路将有助于避免气泡的产生。
目前正在进行对设备的改进，以实现在单次实验中使用多个腔室和多种处理条件。 我们认为，这些设备可用于研.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 # 1R01CA120825-01A1、马萨诸塞大学阿默斯特分校协作生物医学研究（CBR）项目以及对 Bhushan J. Toley 提供的伊森伯格奖学金的支持。我们衷心感谢 James Schafer 作为本视频的摄像师、解说员和编辑所做出的宝贵贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅胶弹性体试剂盒 | 埃尔斯沃思胶粘剂 | 184 型硅胶弹性体试剂盒 | |
| Miltex 活检穿孔器 | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE 管 | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| 雄性鲁尔锁接头 | Qosina | 65111 | |
| 带倒刺的雌性鲁尔锁接头 | Qosina | 11556 | |
| 截止阀 | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y型连接器 | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" 针 | BD 生物科学 | 305176 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW 荧光素 | Biovision 公司 | K183-25 | |
| CaspGLOW 红色 | Biovision 公司 | K193-25 | |
| 盐酸多柔比星 | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | 人结肠癌细胞系 |
| T47D | ATCC | HTB-133 | 人导管癌细胞系 |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | 人乳腺腺癌细胞系 |
参考文献
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K.
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重印与许可
