Summary
Evaluation der Kolonmotilität beim Meerschweinchen distalen Kolon mit dem Magen-Darm-Motilität Monitor (Gimm) ist ein einfaches und leicht zu erlernen Ansatz quantitativ zu bewerten propulsiven Motilität im Magen-Darm-Trakt.
Abstract
Die gastrointestinale Motilität Monitor (Gimm; Catamount Forschung und Entwicklung; St. Albans, VT) ist ein in vitro System, das treibende Beweglichkeit in isolierten Segmenten des Meerschweinchens distalen Kolon-Monitore. Das komplette System besteht aus einem Computer, einer Videokamera, beleuchtet Organbad, Schlauchpumpen und beheiztem Wasserbad Umwälzpumpen und benutzerdefinierte Gimm Software zur Aufzeichnung und Analyse von Daten. Verglichen mit traditionellen Methoden der Überwachung colonic Peristaltik, ermöglicht die Gimm System für die kontinuierliche, quantitative Auswertung der Motilität. Das Meerschweinchen distalen Kolon ist in erwärmt, mit Sauerstoff Krebs-Lösung gebadet, und Exkremente in der mündlichen Ende eingefügt werden zusammen das Segment der Doppelpunkt mit einer Rate von etwa 2 mm / sec angetrieben. Filme der fäkalen Pellets Verfahren entlang des Segments erfasst werden, und die Gimm Software kann benutzt werden, den Fortschritt der fäkalen Pellets werden. Preise von propulsiven Motilität kann für das gesamte Segment oder für einen bestimmten Bereich von Interesse erhalten werden. Neben der Analyse der Bolus-induzierte Motilität Mustern können raumzeitliche Karten aus aufgenommene Video Segmenten aufgebaut werden, um spontane motorische Aktivität Muster zu beurteilen. Anwendungen dieses Systems sind pharmakologischen Evaluierung der Auswirkungen von Rezeptor-Agonisten und Antagonisten auf propulsiven Motilität, sowie Beurteilung der Veränderungen, die sich aus pathophysiologischen Bedingungen, wie Entzündungen oder Stress. Das Meerschweinchen distalen Kolon propulsiven Motilität Assay, mit dem Gimm Systems ist unkompliziert und einfach zu erlernen, und es bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Beurteilung der treibenden Motilität.
Protocol
1. Vorbereitung des Colon Tissue für Gimm
- Um ein Segment des distalen Kolon für die gastrointestinale Motilität Monitor (Gimm), den ersten Platz der isolierten Doppelpunkt im eiskalten Krebs-Lösung (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2, 25 mM NaHCO 3 vorbereiten , 1,2 mM NaH 2 PO 4 und 8 mM Glucose, mit 95% O 2 / 5% CO 2 Kohlensäure). Wegzuräumen verbleibenden Mesenterium von der Außenwand und einen kleinen Einschnitt in der mündlichen Ende so kann es zu unterscheiden, wenn sie in das Organbad platziert werden. Hinweis: Gewebe kann in Eiswasser Krebs-Lösung für bis zu 2 Stunden vor dem Experiment bleiben.
- Anschließend positionieren Sie den Zufluss und Abfluss Leitungen in das Organbad, so dass sie außerhalb der Kamera Feld, um Interferenzen mit der Bildaufnahme zu verhindern. Kontinuierlich perfuse das Organbad mit vorgewärmten (37 ° C) mit Sauerstoff (95%, 5% CO 2) Kreb-Lösung mit einer Flussrate von 10 ml / min.
- Die Verfolgung der mündlichen vs anal endet, Pin ein Segment des distalen Kolon (mindestens 5 cm) an beiden Enden in das Organbad, so dass ein geringer Grad an Lockerheit, so dass das Segment frei bis zu 1 cm bewegen sich in der Mitte . Die orale Ende sollten sich die Forscher für eine einfache Platzierung der fäkalen Pellets positioniert werden. Colon-Segmente sollten in der gleichen Weise von den gleichen Forscher für jedes Experiment innerhalb einer gegebenen Reihe von Experimenten merken werden, weil die Länge und Spannung des Segments beeinflusst die Rate der treibenden Motilität, mit Längsdehnung Verringerung der Geschwindigkeit des Transits (Dickson et al. , 2007).
- Lassen Sie die Vorbereitung für mindestens 30 min äquilibriert.
2. Einrichten Gimm and Data Acquisition
- In der Gimm System ist die Colon-Segment in der Perfusionskammer von unten beleuchtet. Eine digitale Videokamera mit einem Computer verbunden ist oberhalb der Kammer positioniert. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Beleuchtung Quelle und Gimm Software eingeschaltet sind.
- Nach dem Einrichten eines neuen Versuch in der Gimm Software-Anwendung, beginnt der erste Prozess, indem Sie ein Epoxid-beschichtete fäkalen Pellets in der mündlichen Ende des Kolon-Segment, die Peristaltik zu initiieren. Klicken Sie auf das Kamera-Umschalter auf dem Computer, um die Kamera einzuschalten, und klicken Sie auf die Record-Taste, um die Aufnahme zu starten. Die Bewegung der Pellets in den analen Richtung ist von der Videokamera aufgezeichnet und die digitalen Filme auf dem PC zur späteren Auswertung gespeichert. Wenn das Pellet wurde am Ende des Dickdarms Segment erreicht, klicken Sie auf die Record-Taste, um die Aufnahme zu stoppen.
- Um eine Kontrolle Wert für die Rate der Antrieb, mit einem Kolon-Segment von einem gesunden Tier und ohne Anwendung Drogen beginnen. Conduct 3-5 Versuche in einer Zubereitung mit einer Erholungszeit von 5 min zwischen den einzelnen Ausführungen.
- Zur Bestimmung der Wirkung von bestimmten Bedingungen oder Drogen am Kolonmotilität, führen 3-5 Studien / Vorbereitung für jeden experimentellen Zustand. Darüber hinaus führen jedes Experiment auf mindestens fünf verschiedene Doppelpunkte aus mindestens fünf verschiedenen Tieren.
- In der Analyse der digitalen Filme, ist die Rate der fäkalen Pellets Antrieb wie die Zeit es dauert, ein Diabolo X cm des Dickdarms Segment durchlaufen berechnet.
3. Bau Spatiotemporal Karten
- Die digitale Videos von einzelnen Gimm läuft erworben werden können, um raumzeitliche Karten mithilfe der benutzerdefinierten Gimm Software konvertiert werden.
- Auf der horizontalen Achse werden die Änderungen in Kolon-Durchmesser im Laufe der Zeit durch die Umwandlung des Bildes des Dickdarms in jedes Videobild eine Silhouette, und die Berechnung und Umwandlung der Durchmesser über die gesamte Länge in Graustufen dargestellt. Das Endergebnis ist, dass die Pellets und Bereiche der Entspannung schwarz erscheinen, während Bereiche der Kontraktion weiß erscheinen.
- Der Abstand von der Pellet durch die Kolonsegment gereist ist auf der vertikalen Achse dargestellt.
4. Vertreter Spatiotemporal Karten
- Dargestellt sind repräsentative raumzeitlichen Karten mit Pellet-Motilität in Kolon-Segmente unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Die y-Achse (vertikal) stellt Pellet Position im Laufe der Zeit, während die x (horizontal) Achse repräsentiert die Distanz, die das Pellet durch die Kolonsegment fortgeschritten ist.
- In der raum-zeitlichen Karte von einem Kontrollraum Doppelpunkt (unbehandelt, normal), wird das Pellet verlaufe linear mit einer Rate von ~ 2 mm / sec. Im Gegensatz dazu kann die Verabreichung bestimmter Medikamente oder Entzündungen im Dickdarm in gestörten Beweglichkeit Muster wie gestoppt Motilität und behindert Beweglichkeit führen.
- Die Ergebnisse aus Gimm kann auch als Grafiken gezeigt werden, in denen die y-Achse den Abstand in Millimetern durch eine fäkale Pellet und der x-Achse die Zeit in Sekunden reiste darstellt. Zum Beispiel, Verwaltung DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5), einOpiat-μ-Rezeptor-Agonist, führt zu einer Abnahme in propulsiven Motilität im Darm.
Discussion
Nerve-vermittelte propulsiven Motilität im Magen-Darm-Trakt wurde zum ersten Mal über einem Jahrhundert von Bayliss und Starling (Bayliss und Starling, 1899) beschrieben. Diese Beobachtung führte zu der Bezeichnung der Nerven des Darms wie die enterale Nervensystem (ENS), eine deutliche Teilung des vegetativen Nervensystems (Langley, 1921). Neurogene Darmperistaltik beinhaltet strecken und / oder Schleimhaut Stimulation zu einem bestimmten Zeitpunkt und Reflex-vermittelte Kontraktionen oben oder mündlich zu, das Niveau der Reiz und Entspannung in der aboralen Richtung. Das Ergebnis ist die Erzeugung eines Druckgradienten, dass der luminalen Inhalte in einer mündlichen zu aboralen Richtung treibt. In der Dünndarm von einer Vielzahl von Arten, und in der Ratte Dickdarm, können peristaltische Wellen der Kontraktionen durch Infusion von Flüssigkeit in das Lumen des Segmenten Darm aktiviert werden. Beim Meerschweinchen distalen Kolon, können natürliche oder künstliche Kot-Pellets in das orale Ende des Dickdarms eingesetzt werden und ihre Fortschritte auf dem Segment der Doppelpunkt können einfach überwacht werden. Somit stellt die Meerschweinchen distalen Kolon eine einfache und nützliche Assay zur Untersuchung propulsiven Motilität im Darm.
Peristaltik ist ein komplexes neuronales Reflex, der eine Reihe von neuroaktiven Verbindungen und Rezeptoren besteht. Als Ergebnis beeinflussen Verbindungen, die Neurotransmission beeinflussen in der ENS die Rate der treibenden Motilität. Serotonin, vor allem aus enterochromaffinen Zellen in der Darmschleimhaut freigesetzt wird, ist in der Einleitung des peristaltischen Reflex beteiligt. Mit den Meerschweinchen distalen Kolon, Grider und Kollegen zeigten, dass propulsiven Motilität von intraluminalen Verabreichung von 5-HT 4-Rezeptor-Agonisten (Foxx-Orenstein et al, 1998..; Grider et al, 1998) erhöht, während Bad Anwendungsgebiete von 5 -HT 3-und 5-HT 4-Rezeptor-Antagonisten sinkt die Rate der Antrieb (Kadowaki et al, 1996;. Linden et al, 2003b).. Darüber hinaus erhöht sich die Hemmung der Serotonin-Transporter mit Serotonin selektiven Wiederaufnahmehemmer (SSRI) Peristaltik bei niedrigen Konzentrationen, noch nimmt Peristaltik bei höheren Konzentrationen, wahrscheinlich aufgrund einer Desensibilisierung der 5-HT-Rezeptoren (Kadowaki et al, 1996;.. Wade et al, 1996). Andere Signalmoleküle, die Meerschweinchen treibende Beweglichkeit beitragen, umfassen Acetylcholin Schauspiel an Nikotinrezeptoren, die den primären Mediator interneuronalen Signalisierung im Darm ist. Blocking synaptischen Übertragung mit der Nikotinsäure-Rezeptor-Antagonist Hexamethonium sinkt Pellet Antrieb bei hohen Konzentrationen, während geringere Konzentrationen nicht auf die Geschwindigkeit des Antriebs (Kadowaki et al., 1996). Opiate und Opioid-Rezeptor-Agonisten, die seit langem bekannte hemmende Wirkung auf die gastrointestinale Motilität haben, verringern Pellet Vortrieb beim Meerschweinchen propulsiven Motilität Modell (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Wood et al, 2009). Interessanterweise nimmt daikenchuto, einem traditionellen japanischen Kräutermedizin klinisch zu Erbrechen, Magenschmerzen, und ungeordneten Beweglichkeit zu behandeln, die Rate der Pellet-Antrieb, wenn mit dem Opioid-Antagonisten Naloxon verabreicht wird, und wenn allein verabreicht, die Ergebnisse in umgekehrter Peristaltik (Wood et al. 2009). Diese Ergebnisse verdeutlichen den Nutzen der Meerschweinchen propulsiven Motilität Modell, um die Beiträge der verschiedenen Verbindungen und deren Rezeptoren auf Kolonmotilität Muster zu beurteilen.
Eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass die Entzündung auf Veränderungen in der elektrischen und synaptischen Eigenschaften der Kolon-Neuronen (Linden et al, 2003a..; Lomax et al, 2005) führt, und dass diese Veränderungen können für Wochen nach Genesung von Entzündung fortbestehen (Krauter . et al, 2007; Lomax et al, 2007).. Die Auswirkungen der Colitis-induzierten neuroplastische Veränderungen auf propulsiven Motilität kann in das Meerschweinchen distalen Kolon mit dem Gimm System untersucht werden. Dieses System hat mehrere Vorteile gegenüber der traditionellen Methode der Überwachung Kolonmotilität, die treibende Beweglichkeit beurteilt, indem Sie einfach das Messen der Zeit eine fäkal Pellets reist einer bestimmten Entfernung. Frühere Studien der Entzündung induzierten neuronalen Plastizität im Dickdarm haben gezeigt, gibt es einen Rückgang in der Geschwindigkeit des Pellet-Antrieb (Linden et al, 2003a;.. Linden et al, 2005), doch neuere Untersuchungen über die Gimm System mehr enthüllt komplexen Veränderungen (Strong et al., 2010). Zum Beispiel ist die Rate der Pellet-Antrieb in ulzeriert Regionen des entzündeten distalen Kolon gesunken, beträgt aber Motilität ist in den angrenzenden Regionen, ein Phänomen, das nicht von der älteren "Stoppuhr"-Methode anerkannt wurde beschleunigt. Andere Studien haben gezeigt, dass dysmotility während der aktiven Phase der Entzündung mit der Hemmung der COX-2 (Linden et al., 2004), noch verändert Motilität, die über anhält wiederhergestellt werden könnendie Auflösung der Entzündung ist COX-2 unempfindlich (Krauter et al., 2007). Außerdem in dieser späteren Studien zeigte raumzeitlichen Karten durch die Gimm System erzeugt eine schrittweise Muster Kolonmotilität, dass in post-entzündlichen Tiere, die auf die verminderte Sätze des Antriebs beiträgt beobachtet wurde.
Abschließend die Meerschweinchen distalen Kolon propulsiven Motilität Assay stellt einen hohen Durchsatz Mittel zur Messung der Wirkungen von Testsubstanzen und pathologischen Bedingungen auf Kolonmotilität, Darüber hinaus bietet das Gimm System eine einfache und unkomplizierte Annäherung an Kolon propulsiven Motilität in vitro zu beurteilen. Es ermöglicht die kontinuierliche Messung der Pellet-Antrieb, sowie die Erzeugung von raum-zeitlichen Karten zu spontanen Aktivitätsmuster zu untersuchen. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden verglichen werden, kann es auch Ertrag mehr komplexes Phänomen, das quantitativ und kann erneut analysiert verschiedene Möglichkeiten, wie digitale Dateien auf dem System gespeichert und sind leicht zugänglich.
Disclosures
Die Produktion dieses Video wurde von Catamount Forschung und Entwicklung, Inc, der das Gerät in diesem Artikel verwendet produziert gesponsert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
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