Summary
Avaliação da motilidade colônica no cólon distal de cobaia com o Monitor de Motilidade Gastrointestinal (GIMM) é uma abordagem direta e simples de aprender a avaliar quantitativamente a motilidade propulsora do trato gastrointestinal.
Abstract
O Monitor de Motilidade Gastrointestinal (GIMM; Research Catamount e Desenvolvimento; St. Albans, VT) é um sistema in vitro que monitora a motilidade propulsora em segmentos isolados do cólon guiné porco distal. O sistema completo consiste de um computador, câmera de vídeo, banho órgão iluminado, banho de água aquecida e que circulam peristáltica bombas e software GIMM personalizado para registrar e analisar dados. Comparado com os métodos tradicionais de monitoramento peristaltismo do cólon, o sistema permite GIMM para avaliação, contínua quantitativa da motilidade. O cólon distal cobaia é banhado em solução de Krebs aquecido, oxigenado, e pelotas fecais inserido no final oral são movidos ao longo do segmento do cólon a uma taxa de cerca de 2 mm / seg. Filmes do processo de pelotas fecais ao longo do segmento são capturadas, eo software pode ser usado GIMM acompanhar o andamento da pelota fecal. Taxas de motilidade propulsiva pode ser obtido para todo o segmento ou para qualquer região de interesse particular. Além da análise de padrões de bolus induzida motilidade, mapas espaço-temporal pode ser construído a partir de segmentos de vídeo capturado para avaliar padrões de atividade espontânea motor. Aplicações deste sistema incluem avaliação farmacológica dos efeitos de agonistas e antagonistas do receptor sobre a motilidade propulsora, bem como avaliação das mudanças que resultam de condições fisiopatológicas, tais como inflamação ou stress. A cobaia distal do cólon ensaio motilidade propulsiva, utilizando o sistema GIMM, é direto e simples de aprender, e fornece um método confiável e reprodutível de se avaliar a motilidade propulsora.
Protocol
1. Preparação de tecido do cólon para GIMM
- Para preparar um segmento do cólon distal para o Monitor de Motilidade Gastrointestinal (GIMM), o primeiro lugar isolado do cólon na gelada solução de Krebs (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2, 25 mM NaHCO 3 , 1,2 mM NaH 2 PO 4 e 8 de glicose mM; aerado com 95% O 2 / 5% CO 2). Limpar mesentério restante da parede exterior e fazer uma pequena incisão no final oral, para que ele possa ser distinguido quando colocado no banho de órgãos. Nota: o tecido pode permanecer em solução Krebs gelada por até 2 horas antes da experimentação.
- Em seguida, posicione a condutas entrada e saída no banho de órgãos para que eles estão fora do campo da câmara para evitar a interferência com a aquisição da imagem. Continuamente perfundir o banho órgão com pré-aquecido (37 ° C) oxigenada (95%, 5% CO 2) solução de Krebs a uma vazão de 10 ml / min.
- Manter o controle das extremidades oral versus anal, pin um segmento do cólon distal (pelo menos 5 cm) em cada extremidade no banho de órgãos, permitindo que um pequeno grau de flacidez de modo que o segmento pode se mover livremente até 1 cm no meio . O fim oral deve ser posicionada na direção do pesquisador para a facilidade de colocar a pelota fecal. Segmentos do cólon deve ser fixada da mesma maneira pelo mesmo pesquisador para cada experimento dentro de um determinado conjunto de experiências, porque o comprimento e tensão do segmento afeta a taxa de motilidade propulsiva, com extensão longitudinal diminuindo a taxa de trânsito (Dickson et al. , 2007).
- Permitir a preparação para estabilizar durante pelo menos 30 min.
2. Criação GIMM e Aquisição de Dados
- No sistema GIMM, o segmento colônico na câmara de perfusão é iluminada por baixo. Uma câmera de vídeo digital a um computador é posicionado sobre a câmara. Assegurar que tanto a fonte de iluminação de luz e software GIMM estão ligados.
- Depois de configurar uma nova experiência na aplicação de software GIMM, comece o primeiro julgamento, inserindo um pellet epoxy revestido fecal na extremidade oral do segmento colônico para iniciar o peristaltismo. Clique no botão da câmera de alternância no computador para ligar a câmera e clique no botão de gravação para iniciar a gravação. O movimento de sedimento na direção anal é gravado pela câmera de vídeo e filmes digitais são armazenados em um PC para análise posterior. Quando a pelota chegou ao final do segmento colônico, clique no botão gravar para parar a gravação.
- Para obter um valor de controle para a taxa de propulsão, comece com um segmento de cólon de um animal saudável e sem aplicação de drogas. Conduta 3-5 ensaios numa preparação simples, com um período de recuperação de 5 minutos entre cada corrida.
- Para determinar os efeitos de certas condições ou drogas sobre a motilidade do cólon, realizar ensaios 05/03 / preparação para cada condição experimental. Além disso, realizar cada experimento em pelo menos cinco dois pontos diferentes de pelo menos cinco animais diferentes.
- Na análise dos filmes digitais, a taxa de propulsão pelota fecal é calculado como o tempo que leva para uma pelota para atravessar cm X do segmento de cólon.
3. Construção de Mapas Spatiotemporal
- Os vídeos digitais adquiridos de roda GIMM individuais podem ser convertidos para mapas espaço-temporal utilizando o software GIMM personalizado.
- No eixo horizontal, as mudanças no diâmetro do cólon são plotados ao longo do tempo, convertendo a imagem do cólon em cada quadro do vídeo a uma silhueta, e calcular e converter o diâmetro ao longo do comprimento inteiro em escala de cinza. O resultado final é que o pellet e áreas de relaxamento aparecem em preto, enquanto que as áreas de contração aparecem em branco.
- A distância percorrida pelo pellet através do segmento de cólon é representado no eixo vertical.
4. Representante Mapas Spatiotemporal
- Aqui mostrados são representativos mapas espaço-temporais mostrando motilidade pellet em segmentos de cólon sob várias condições experimentais. O eixo y (vertical) representa pellet posição ao longo do tempo, enquanto o eixo x (horizontal) representa a distância que o pellet progrediu através do segmento de cólon.
- No mapa espaço-temporal de dois pontos de controle (sem tratamento, normal), a pelota vai avançar de forma linear a uma taxa de ~ 2 mm / seg. Em contraste, a administração de certas drogas ou inflamação no cólon pode resultar em padrões de motilidade interrompido, como a motilidade parou e motilidade obstruído.
- Resultados de GIMM também podem ser mostrados como gráficos, em que o eixo y representa a distância em milímetros percorrida por uma pelota fecal eo eixo x representa o tempo em segundos. Por exemplo, a administração de DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5), umagonista opiáceo μ-receptor, provoca uma diminuição da motilidade propulsora do cólon.
Discussion
Nervo mediada motilidade propulsiva no trato gastrointestinal foi descrita pela primeira vez mais de um século atrás por Bayliss e Starling (Bayliss e Starling, 1899). Essa observação levou à designação dos nervos do intestino como o sistema nervoso entérico (ENS), uma divisão distinta do sistema nervoso autônomo (Langley, 1921). Peristaltismo intestinal neurogênica envolve estiramento e / ou estimulação da mucosa em um determinado ponto e reflexo contrações mediada acima, ou por via oral para o nível de estímulo e relaxamento na direção aboral. O resultado é a geração de um gradiente de pressão que impulsiona o conteúdo luminal em um oral para direção aboral. No intestino delgado de uma variedade de espécies, e no intestino de ratos grandes, as ondas de contrações peristálticas pode ser ativado pela infusão de líquido no lúmen dos segmentos do intestino. No cólon distal cobaia, natural ou artificial pelotas fecais pode ser inserido na extremidade oral do cólon e do seu progresso ao longo do segmento de cólon pode ser facilmente monitorado. Assim, o cólon distal cobaia oferece um método simples e útil para a investigação de motilidade propulsiva no intestino.
Peristaltismo é um reflexo neural complexa que envolve uma série de compostos neuroactive e receptores. Como resultado, os compostos que afetam a neurotransmissão na ENS afetam a taxa de motilidade propulsora. Serotonina, liberado principalmente a partir de células enterocromafins na mucosa intestinal, está envolvido na iniciação do reflexo peristáltico. Usando a cobaia distal do cólon Grider, e seus colegas demonstraram que a motilidade propulsora é reforçada pela administração intralumenal de 5-HT 4 agonistas do receptor (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Grider et al, 1998), enquanto banho de aplicação de 5 -HT 3 e 5-HT 4 antagonistas do receptor diminui a taxa de propulsão (Kadowaki et al, 1996;. Linden et al, 2003b).. Além disso, a inibição do transportador da serotonina com inibidores seletivos da recaptação da serotonina (SSRIs), aumenta o peristaltismo em baixas concentrações, mas diminui o peristaltismo em concentrações mais elevadas, provavelmente devido à dessensibilização dos receptores 5-HT (Kadowaki et al, 1996;.. Wade et al, , 1996). Outras moléculas de sinalização que contribuem para a guiné porco motilidade propulsiva incluem a acetilcolina agindo em receptores nicotínicos, que é o principal mediador de sinalização interneuronal nos intestinos. Bloqueio da transmissão sináptica com o antagonista dos receptores nicotínicos hexametônio diminui propulsão pellet em altas concentrações, enquanto que as concentrações menores não afetam a taxa de propulsão (Kadowaki et al., 1996). Opiáceos, e agonistas do receptor opióide, que há muito se sabe que têm efeitos inibitórios na motilidade gastrointestinal, diminuição de propulsão pellet no modelo de motilidade cobaia de propulsão (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Wood et al, 2009). Curiosamente, daikenchuto, um medicamento herbal tradicional japonesa usada clinicamente para o tratamento de vômitos, dor de estômago, e motilidade desordenada, diminui a taxa de propulsão pellet quando administrado com o antagonista opióide naloxona, e quando administrado isoladamente, resulta em peristaltismo reverso (Wood et al. 2009). Estes resultados ilustram a utilidade do modelo de mobilidade cobaia propulsora para avaliar as contribuições de vários compostos e seus receptores nos padrões de motilidade do cólon.
Uma série de estudos têm demonstrado que a inflamação leva a mudanças nas propriedades elétricas e sináptica dos neurônios do cólon (Linden et al, 2003a;.. Lomax et al, 2005), e que essas alterações podem persistir por semanas após a recuperação da inflamação (Krauter . et al, 2007; Lomax et al, 2007).. O impacto da colite induzida por alterações na motilidade propulsiva neuroplasticidade pode ser investigado no cólon distal cobaia usando o sistema GIMM. Este sistema tem várias vantagens sobre o método tradicional de monitoramento motilidade colônica, que avalia a motilidade propulsora simplesmente medindo o tempo uma pelota fecal percorre uma determinada distância. Estudos anteriores de plasticidade neural induzida por inflamação no cólon têm indicado que há uma diminuição da velocidade de pellet de propulsão (Linden et al, 2003a;.. Linden et al, 2005), mas investigações mais recentes usando o sistema GIMM revelaram mais mudanças complexas (Strong et al., 2010). Por exemplo, a taxa de pellet de propulsão é diminuída em regiões ulceradas do cólon inflamado distal, mas a motilidade é acelerada em regiões adjacentes, um fenômeno que não foi reconhecido pelo "cronômetro" anteriormente método. Outros estudos têm mostrado que alterações da motilidade durante a fase ativa da inflamação pode ser restaurada com a inibição da COX-2 (Linden et al., 2004), mas a motilidade alterada que persiste aléma resolução da inflamação é COX-2 insensíveis (Krauter et al., 2007). Além disso, nestes estudos posteriores, mapas espaço-temporais gerados pelo sistema GIMM revelou um padrão gradual de motilidade colônica que foi observado em animais pós-inflamatória que contribui para a diminuição das taxas de propulsão.
Em conclusão, a cobaia do cólon distal do ensaio da motilidade propulsora representa uma alta taxa de transferência meios de medir os efeitos dos compostos teste e condições patológicas sobre a motilidade do cólon, além disso, o sistema GIMM fornece uma abordagem simples e direta para avaliar a motilidade propulsora do cólon in vitro. Que permite a medição contínua de pellet de propulsão, bem como a geração de mapas espaço-temporal para estudar padrões de atividade espontânea. Em comparação aos métodos tradicionais, que também pode produzir fenômeno mais complexo que pode ser quantificada e novamente analisadas formas múltiplas como arquivos digitais são salvos no sistema e são facilmente acessíveis.
Disclosures
A produção deste vídeo foi patrocinado pela Pesquisa e Desenvolvimento Catamount, Inc, que produz o instrumento utilizado neste artigo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
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