Summary
Evaluación de la motilidad del colon en el colon distal conejillo de indias con el monitor de la motilidad gastrointestinal (GIMM) es un enfoque sencillo y fácil de aprender para evaluar cuantitativamente la movilidad de propulsión en el tracto gastrointestinal.
Abstract
El monitor de la motilidad gastrointestinal (GIMM, Catamount Investigación y Desarrollo, St. Albans, VT) es un sistema in vitro que controla la motilidad propulsora en segmentos aislados de colon distal conejillo de indias. El sistema completo se compone de un ordenador, una cámara de vídeo, baño de órganos iluminado, baño de agua y se calienta peristálticas bombas de circulación, y el software personalizado GIMM para registrar y analizar datos. En comparación con los métodos tradicionales de control peristalsis del colon, el sistema GIMM permite la evaluación continua y cuantitativa de la motilidad. El colon distal conejillo de indias es bañado en caliente, solución de Krebs oxigenada, y partículas fecales inserta en el extremo orales son impulsados a lo largo del segmento de colon a una tasa de alrededor de 2 mm / seg. Películas del procedimiento de pellets fecales a lo largo del segmento son capturados, y el software GIMM se puede utilizar el seguimiento del progreso de la materia fecal pellets. Las tasas de la motilidad propulsora se puede obtener para todo el segmento, o para cualquier región de interés. Además del análisis de los patrones de la movilidad inducida por bolo, mapas espacio-temporal puede ser construido a partir de segmentos de video capturado para evaluar los patrones de actividad espontánea del motor. Las aplicaciones de este sistema incluyen la evaluación farmacológica de los efectos de los agonistas y antagonistas del receptor de la motilidad propulsora, así como la evaluación de los cambios que se derivan de condiciones fisiopatológicas, como la inflamación o el estrés. El conejillo de indias distal colon ensayo de propulsión motilidad, utilizando el sistema de GIMM, es sencillo y fácil de aprender, y que ofrece un método fiable y reproducible para evaluar la motilidad propulsora.
Protocol
1. Preparación de tejido del colon para GIMM
- Para preparar un segmento del colon distal para el Monitor de Motilidad Gastrointestinal (GIMM), el primer lugar de los dos puntos aislados en helado de solución de Krebs (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl2, 25 mM de NaHCO3 , 1,2 mM NaH 2 PO 4, y 8 mM de glucosa, aireados con 95% O 2 / 5% CO 2). Limpiar mesenterio restante de la pared exterior y hacer una pequeña incisión en el extremo oral por lo que se puede distinguir cuando se coloca en el baño de órganos. Nota: El tejido puede permanecer en solución de Krebs helado de hasta 2 horas antes de la experimentación.
- A continuación, la posición de los conductos de entrada y salida en el baño de órganos por lo que están fuera del campo de la cámara para evitar la interferencia con la adquisición de la imagen. Continuamente perfundir el baño de órganos con precalentado (37 ° C) oxigenada (95%, 5% CO 2) solución de Krebs con un caudal de 10 ml / min.
- Hacer un seguimiento de los extremos oral vs anal, pin de un segmento de colon distal (por lo menos 5 cm) en cada extremo en el baño de órganos, lo que permite un pequeño grado de laxitud para que el segmento se puede mover libremente hasta 1 cm en el centro . Al final oral debe ser orientada hacia el investigador para facilitar la colocación de la materia fecal pellets. Segmentos del colon debe ser depositado en la misma forma por el mismo investigador para cada experimento dentro de un conjunto de experimentos, porque la longitud y la tensión del segmento afecta a la velocidad de la motilidad propulsora, con el estiramiento longitudinal disminución de la tasa de tránsito (Dickson et al. , 2007).
- Deje que la preparación en reposo durante al menos 30 minutos.
2. La creación de GIMM y Adquisición de Datos
- En el sistema de GIMM, el segmento de colon en la cámara de perfusión está iluminada desde abajo. Una cámara de vídeo digital conectado con un ordenador se coloca encima de la cámara. Asegúrese de que tanto la fuente de iluminación de luz y software GIMM están encendidos.
- Después de la creación de un nuevo experimento en la aplicación de software GIMM, comenzará el primer juicio por la inserción de un revestimiento epóxico fecal pellets en el extremo oral del segmento de colon para iniciar el peristaltismo. Haga clic en el interruptor de la cámara alternar en el equipo para encender la cámara y haga clic en el botón de grabación para iniciar la grabación. El movimiento de la bola en la dirección anal es registrado por la cámara de video y las películas digitales se almacenan en un PC para su posterior análisis. Cuando la bolita ha alcanzado el final del segmento de colon, haga clic en el botón de grabación para detener la grabación.
- Para obtener un valor de control de la velocidad de propulsión, comienza con un segmento del colon de un animal sano y sin la aplicación de las drogas. Realizar ensayos 3-5 en una sola preparación, con un período de recuperación de 5 minutos entre cada ejecución.
- Para determinar los efectos de ciertas condiciones o las drogas en la motilidad del colon, realizar ensayos 5.3 / preparación para cada condición experimental. Además, lleve a cabo cada experimento por lo menos en cinco colones diferentes de al menos cinco animales diferentes.
- En el análisis de las películas digitales, la tasa de propulsión fecal pellets se calcula como el tiempo que tarda una bolita de atravesar cm X del segmento de colon.
3. La construcción de mapas espacio-temporal
- Los videos digitales adquiridos de carreras GIMM persona se puede convertir en mapas espacio-temporal con el software GIMM personalizado.
- En el eje horizontal, cambios en el diámetro del colon se trazan a través del tiempo mediante la conversión de la imagen de los dos puntos en cada fotograma de vídeo a una silueta, y el cálculo y la conversión del diámetro a lo largo de toda la longitud en la escala de grises. El resultado final es que el sedimento y áreas de relajación aparecen en negro, mientras que las áreas de la contracción aparecen en blanco.
- La distancia recorrida por el sedimento a través del segmento de colon se representa en el eje vertical.
4. Representante mapas espacio-temporal
- Aquí se muestran los mapas de representación espacio-temporal que muestra la motilidad de pellets en segmentos del colon en diferentes condiciones experimentales. La y (vertical) representa la posición de pellets en el tiempo, mientras que la x (horizontal) representa la distancia que la pastilla progresado a través del segmento de colon.
- En el mapa espacio-temporal de dos puntos de control (sin tratamiento, normal), el pellet se avance de forma lineal a un ritmo de aproximadamente 2 mm / seg. Por el contrario, la administración de ciertos medicamentos o inflamación en el colon puede resultar en patrones de movilidad interrumpido como la motilidad y movilidad detuvo obstruido.
- Los resultados de GIMM también se puede mostrar en forma de gráficos, en la que el eje y representa la distancia en milímetros que recorre un pellet fecales y el eje de abscisas representa el tiempo en segundos. Por ejemplo, la administración de DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-OL5), unopiáceos μ-agonista de los receptores, provoca una disminución de la motilidad propulsora en el colon.
Discussion
Nerviosa mediada por la motilidad propulsora en el tracto gastrointestinal fue descrito por primera vez más de un siglo por Bayliss y Starling (Bayliss y Starling, 1899). Esta observación dio lugar a la designación de los nervios del intestino como el sistema nervioso entérico (SNE), una clara división del sistema nervioso autónomo (Langley, 1921). Peristaltismo intestinal neurogénica implica estirar y / o la estimulación de la mucosa en un punto dado y el reflejo de las contracciones mediadas por encima o por vía oral para el nivel de estímulo y relajación en la dirección aboral. El resultado es la generación de un gradiente de presión que impulsa el contenido luminal en un informe oral a la dirección aboral. En el intestino delgado de una variedad de especies, y en el intestino de la rata grande, ondas peristálticas de las contracciones puede ser activado mediante la infusión de líquido en el lumen de los segmentos del intestino. En el colon distal conejillo de indias, bolitas fecales natural o artificial puede ser insertado en el extremo oral del colon y su progreso a lo largo del segmento de colon se puede controlar fácilmente. Por lo tanto, el colon distal conejillo de indias proporciona un ensayo simple y útil para la investigación de la motilidad propulsora en el intestino.
El peristaltismo es un reflejo complejo neural que implica una serie de compuestos neuroactivos y receptores. Como resultado, los compuestos que afectan la neurotransmisión en la ENS afectar la tasa de la motilidad propulsora. La serotonina, liberada principalmente por las células enterocromafines en la mucosa intestinal, está involucrado en el inicio de la peristáltica refleja. Utilizando el conejillo de indias colon distal Grider, y sus colegas demostraron que la motilidad de propulsión se ve reforzada por la administración intraluminal de 5-HT 4 agonistas de los receptores (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Grider et al, 1998), mientras que baño de la aplicación de 5 -HT3 y 5-HT 4 antagonistas del receptor disminuye la velocidad de propulsión (Kadowaki et al, 1996;. Linden et al, 2003b).. Además, la inhibición del transportador de serotonina con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS) aumenta el peristaltismo en concentraciones bajas, sin embargo, disminuye la peristalsis en concentraciones más altas, probablemente debido a la desensibilización de los receptores 5-HT (Kadowaki et al, 1996;.. Wade et al, , 1996). Otras moléculas de señalización que contribuyen a la movilidad de cerdo de Guinea propulsores incluyen acetilcolina actúa en los receptores nicotínicos, que es el principal mediador de la señalización interneuronal en los intestinos. El bloqueo de la transmisión sináptica con el antagonista de los receptores nicotínicos de hexametonio disminuye la propulsión de pellets en altas concentraciones, mientras que concentraciones menores no afectan a la velocidad de propulsión (Kadowaki et al., 1996). Los opiáceos y los agonistas de los receptores opioides, que desde hace tiempo se sabe que tienen efectos inhibitorios sobre la motilidad gastrointestinal, disminución de la propulsión de pellets en el modelo de conejillo de indias motilidad propulsora (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Wood et al, 2009). Curiosamente, daikenchuto, una medicina tradicional japonesa a base de hierbas utilizado clínicamente para tratar el vómito, dolor de estómago, trastornos de la motilidad y, disminuye la velocidad de propulsión pellet cuando se administra con naloxona, antagonista de los opiáceos, y cuando se administran solos, los resultados de la peristalsis inversa (Wood et al. 2009). Estos resultados ilustran la utilidad del modelo de conejillo de indias motilidad propulsora para evaluar las contribuciones de varios compuestos y sus receptores en los patrones de la motilidad colónica.
Un número de estudios han demostrado que la inflamación conduce a cambios en las propiedades eléctricas y sináptica de las neuronas del colon (Linden et al, 2003a;.. Lomax et al, 2005), y que estos cambios pueden persistir durante semanas después de la recuperación de la inflamación (Kräuter . et al, 2007; Lomax et al, 2007).. El impacto de la colitis inducida por los cambios en la motilidad propulsora neuroplásticos pueden ser investigados en el colon distal conejillo de indias con el sistema GIMM. Este sistema tiene varias ventajas sobre el método tradicional de control la motilidad del colon, que evalúa la motilidad propulsora simplemente midiendo el tiempo que un pellet fecales recorre una distancia determinada. Los estudios previos de la inflamación inducida por la plasticidad neural en el colon han indicado que hay una disminución en la velocidad de la bolita de propulsión (Linden et al, 2003a;.. Linden et al, 2005), sin embargo, investigaciones más recientes que utilizan el sistema GIMM han revelado más cambios complejos (Strong et al., 2010). Por ejemplo, la tasa de pellet de propulsión es la disminución en las regiones ulceradas de la porción distal del colon inflamado, sin embargo, la movilidad se acelera en las regiones adyacentes, un fenómeno que no fue reconocido por el anterior "cronómetro" método. Otros estudios han demostrado que la alteración de la motilidad durante la fase activa de la inflamación puede ser restaurado con la inhibición de la COX-2 (Linden et al., 2004), sin embargo, alteración de la motilidad que persiste más allála resolución de la inflamación es la COX-2 insensible (Kräuter et al., 2007). Además, en estos últimos estudios, mapas espacio-temporales generados por el sistema GIMM reveló un patrón escalonado de la motilidad del colon que se observó en los animales post-inflamatoria que contribuye a la disminución de las tasas de propulsión.
En conclusión, el conejillo de indias distal ensayo de la motilidad del colon de propulsión de alto rendimiento representa un medio para medir los efectos de los compuestos de prueba y las condiciones patológicas en la motilidad del colon, además, el sistema GIMM proporciona un enfoque simple y directo para evaluar la motilidad propulsiva del colon in vitro. Permite la medición continua de pellet de propulsión, así como la generación de mapas espacio-temporal para estudiar los patrones de actividad espontánea. En comparación con los métodos tradicionales, sino que también puede dar fenómeno más complejo que puede ser cuantificada y volvieron a analizar múltiples maneras como los archivos digitales son guardados en el sistema y son fácilmente accesibles.
Disclosures
La producción de este video fue patrocinado por la Investigación y el Desarrollo Catamount, Inc, que produce el instrumento utilizado en este artículo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
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