במושבה שמרים והטבעה שיטה

Summary

שיטה להטבעת מושבות שמרים המאפשר חתך של מיקרוסקופ אור אלקטרונים. פרוטוקול זה מאפשר קביעה של חלוקת תאים sporulated ותאי pseudohyphal בתוך מושבות מתן כלי חדש לקראת הבנת הארגון של סוגי תאים בתוך קהילה פטרייתי.

Abstract

דפוסים של סוגי תאים שונים העוברים הוא מנגנון מרכזי בפיתוח מטזואניים. הקהילות של מיקרואורגניזמים, כגון מושבות biofilms גם להציג דפוסים של סוגי תאים. לדוגמה, שמרים ס cerevisiae, תאים sporulated ותאי pseudohyphal אינם מפוזרים באופן אחיד במושבות. החשיבות התפקודית של דפוסים המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הדפוסים הללו הם עדיין ממעטים להבין.

אתגר אחד ביחס לחקור דפוסים של סוגי תאים במושבות פטרייתי היא שבניגוד מטזואניים רקמות, תאים במושבות יחסית מצורף חלושות אחד לשני. בפרט, מושבות פטריות אינם מכילים את רמת נרחב זהה של תאי מטריקס נמצא ברוב הרקמות. כאן אנו מדווחים על שיטה להטבעת ו חתך מושבות שמרים החושף את דפוסי הפנים של סוגי תאים במושבות אלה. השיטה יכולה לשמש כדי להכין חלקים עבים (0.5 μ) שימושי במיקרוסקופ אור וחתכים דקים (0.1 μ) מתאים במיקרוסקופ אלקטרונים השידור. תאים Asci ו pseudohyphal ניתן בקלות להבחין בין תאים שמרים דמוי ביצה על ידי מיקרוסקופ אור, ואילו המבנה הפנימי של תאים אלה ניתן דמיינו ידי EM.

השיטה מבוססת על הסובבים מושבות עם אגר, שחדר אותם עם המדיום של Spurr ולאחר מכן חתך. מושבות בקוטר בטווח של 1-2 מ"מ מתאימים פרוטוקול זה. בנוסף לדמיין את הפנים של מושבות, השיטה מאפשרת הדמיה של האזור של המושבה כי פולש אגר הבסיסית.

Protocol

1. במושבה בידוד קיבוע

1. דגירה 300 מושבות על אגר בינוני בפעם המצוין (מושבה מבודדת צריך להיות 1-2 מ"מ קוטר).
2. הסר המושבה (את הפנים) ובינוניים הבסיסית בעזרת מרית צרה.
3. מניחים מספר טיפות של אגר 2% 42 ° C בשקופית באמצעות מיקרוסקופ 1 מ"ל pipetman קצה ומיד המושבה מקום על פני אגר לפני שזה מתמצק.
4. מניחים מספר טיפות של אגר 2% 42 ° C על המושבה ולאפשר לגבש.
5. לבשו כפפות על צעדים במשך כל שארית של פרוטוקול זה
6. לחסום חתוך עם סכין גילוח ומכניסים אותם בקבוקון 3.5 מ"ל בורג מכסה בורוסיליקט paraformaldehyde המכיל 2% / מקבע glutaraldehyde 2% למשך 7 ימים בבית 4 ° C.

2. רוחצת וטיפול אוסמיום

1. אחרי שבוע בערך 1, לשטוף בלוקים אגר על הקרח מתחת למכסה המנוע כימי קטר ידי דוגרים פעמיים במשך 15 דקות עם cacodylate 0.15M מספיק נתרן (pH 7.2) כדי לכסות לחלוטין את המושבה (כ 1.5 מ"ל) ולאחר מכן עוד פעמיים במשך 5 דקות עם אותו נפח של 1X OS חיץ (100 מ"מ KH ₂ PO ₄ 10 mM MgCl _2, pH 6.0).
2. מוסיפים את נפח זהה של OSO 1% ₄ [2 מ"ל OSO ₄ (2%) + 2 מ"ל 2x OS הצפת] כדי בקבוקונים (על הקרח) כדי לכסות את קוביות אגר מתחת למכסה המנוע כימי לרתוח במשך שעה 1 ואז לשטוף פעמיים עם אותו סכום של 1X OS חיץ במשך 10 דקות כל אחד.
3. השאר מבחנות לילה ב 4 ° C במאגר OS 1X.
4. מקבע וכל שוטף בשלב זה הם נפטרים כמו פסולת מסוכנת. Pipettes כל המכיל OSO ₄ היו שטופים 3X עם שמן צמחי.

3. לשטוף והתייבשות

1. לשטוף למחרת בבוקר אגר חוסם פעמיים על קרח עם נפח זהה מעל מים קרים במשך 10 דקות כל אחד באמצעות פיפטה פסטר.
2. לשטוף ברצף עם נפח זהה של 25%, 50%, 75%, אתנול 95% במשך 10 דקות כל אחד ואחריו 2 שוטף עם אתנול 100% במשך 10 דקות. השאירו לילה בשעה 4 ° C באתנול 100%.
3. שוטף כל בשלב זה הם נפטרים כמו פסולת מסוכנת.

4. Spurr של הכנה

1. למחרת בבוקר (מוקדם ככל האפשר) לשקול את הפתרונות הבאים (EM למדעים) לתוך כוס פלסטיק חד פעמיות מתחת למכסה המנוע קטר להכין ריאגנט של Spurr. במשך כל העבודה שלאחר מכן באמצעות מגיב, להמשיך להשתמש ברדס קטר.
   (ERL 4221 פתרון 5 גרם)
   (DER 736 פתרון 4 גרם)
   (פתרון NSA 13 גרם)
2. שילוב פתרונות אלה (לאט) במשך 20 דקות במנדף באמצעות בר ומערבבים
3. הוסף פתרון DMAE 0.15 גרם ומערבבים 20 דקות לעיל.
4. דגה התערובת מעל ל 1-2 שעות במנדף.

5. Spurr של הסתננות

1. ברגע של Spurr עשוי לשטוף את רחובות אגר 5 פעמים עם נפח זהה של מעל 100 אתנול חדר temp% במשך 10 דקות כל אחד. לאחר לשטוף את אתנול האחרון להסיר את אתנול באמצעות פיפטה פסטר כך אתנול שנותרו רק מכסה את אבני אגר.
2. הוסף כ כמות זהה של מגיב של Spurr (כ 0.5 מ"ל) ולסובב צלוחיות על ההגה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאפשר לעמוד במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות להסיר את הפתרון לחלוטין בעזרת פיפטה פסטר, להוסיף Spurr של לכסות לחסום אגר (כ 1.5 מ"ל), לסובב צלוחיות על ההגה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאפשר לעמוד במשך 30 דקות. חזור על החלפה של Spurr, סיבוב הדגירה 3 פעמים יותר.
3. לאחר 30 הדקות האחרונות, להסיר מגיב של Spurr ולהוסיף טרי Spurr של לכסות את רחובות. אפשר בלוקים אגר לעמוד טמפ החדר למשך 4 שעות.
4. החלף את Spurr של ולסובב לילה.
5. בבוקר להחליף Spurr של ולהשאיר מסתובב עד יום המחרת.
6. Spurr הבא במקום בבוקר של בתבניות סיליקון ממוספרים (פישר סיינטיפיק) רק כדי לכסות את החלק התחתון של תבניות ולאחר מכן להוסיף קוביות אגר עם תבניות. לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות
7. לאחר 4 שעות, מעל גבי תבניות, עם יותר Spurr ושל דגירה ב 60 ° C במשך הלילה.
8. אם לאחר הסרת אבני מתבניות בלוקים עדיין גמיש מעט, לחזור אל תבניות דגירה נוסף 2 ימים

6. חתך

1. Microtome Ultracut S לייקה שימש לקצץ בסעיפים 0.5 μ עבה של מיקרוסקופ אור 0.1 μ סעיפים דק עבור EM השידור.
2. עבור במיקרוסקופ אור, כמו החלקים נחתכו, הם הונחו על ירידה של DH ₂ O, מיובשים על בלוק 52 מעלות צלזיוס חום. קטעים יבשים היו מוכתמים אז עם ירידה של 1.0% toluidine כחול, borate סודיום 1% עבור 5-15 שניות. לאחר מכתים, הסעיפים נשטפו מיד תחת זרם של מים, יבשים, מכוסה התקשורת הרכבה (KPL), וכן תלוש cover חתום על המדגם.

> 7. נציג תוצאות:

הרלוונטיות רחב למדידת היווצרות דפוס בשמרים ומיקרואורגניזמים אחרים נבדקו בעבר ^1. שים לב במיוחד הוא פונקציונליות מוגברת של מושבות מיקרוביאלי מאורגן היחסית לקהילות מאורגן.

השיטה המתוארת הוא שינוי של שיטה להטבעת מושבות התמחה גדול ² ו תיאור קצר של שינויים שלנו פורסמה ^3.

דוגמה מיקרוסקופ אור קטע דרך מרכז במושבה של פרא S. שמרים המושבה cerevisiae מוצג באיור 1. Asci, pseudohyphae ושמרים אובאלית וניתן להבחין בקלות, והאזור המושבה פולשים agar שבבסיס ניכרת גם.

דוגמה מיקרוסקופ אלקטרון של זן מעבדה של שמרים (W303 רקע) הוא שמוצג באיור 2. התמונה מאזור המושבה המכיל בתדירות גבוהה של תאים sporulated.

באיור 1. מיקרוסקופיה Light של מושבה שמרים פרא. שמרים זו (YPS133) היה מבודד לאחרונה מן ולפליטות עץ ^4. המושבה הודגר עבור 6 ימים על YNA בינוני ⁵ לפני חתך. חיצים פתח מצביעים נציג asci, חיצים מילאו מצביעים נציג תאים וגטטיבי אובאלית, ראשי חץ מילאו מצביעים שרשראות של תאים מאורכים (pseudohyphae) ו asci.

באיור 2. אלקטרונים מיקרוסקופית של זן שמרים מעבדה. המושבה של SH1020 (W303 רקע) הודגר עבור 6 ימים על בינוני YNA לפני חתך ^3. Image מראה האזור הסעיף עם תדירות גבוהה של asci. החץ מציין את מבנה דו שכבת הקיר נבג.

איור 3. כימות בחלוקת תאים sporulated במושבות: A) רשת המכיל 15 מלבנים הסמוך מוערמים לאורך הצד ארוך שלהם הוא גבי האזור מרכזי של דימוי סעיף קולוניה. רשת היא scaled, תוך שמירה הפרופורציות שלה מתמדת, פשוט מכסה את העליון והתחתון המושבה. (B & C) שבריר תאים sporulated במלבן כל היחסית לתאי סך במלבן כי נקבעת לפי בדיקה חזותית הדימויים מן 4-יום הישן (B) 8-יום הישן (C) מושבות. לדוגמה, את המלבן בחלקו העליון של המושבה (שכותרתו "1") המתאים בצד שמאל של הגרף. Mean של 4 מושבות מוצג; הסורגים שגיאה התצוגה std. שגיאה.

Discussion

השיטה הציג חושף את המבנים הפנימיים של המושבות. בגלל השיטה יעילה בקביעת הדפוסים של סוגי תאים בטווח של ס זנים cerevisiae עם מורפולוגיות מושבה שונה, גם מינים הקשורים ס paradoxus ^5, השיטה היא גם נוטים לעבוד על מגוון רחב של פטריות ומיקרואורגניזמים אחרים.

צעד קריטי להצלחה של השיטה היא להבטיח את המושבה כולה, כולל החלק העליון של המושבה, הוא עטוף בכל פרוטוקול אגר. אם המושבות נארזים לחלוטין אגר ניתן לקבוע לאחר חתך עבור מיקרוסקופיה מכתים אור עם toluidine כחול. כאשר הסעיפים מוכתם נתפסים על ידי מיקרוסקופ אור, המדיום אגר הוא מוכתם מעט כהה יותר המדיום הטבעה. מכיוון מתכווץ אגר במהלך השלבים dehydrations, על מנת לשחזר את המושבה כולה כדי להיות בטוח: 1) להוסיף 4-5 טיפות של אגר באופן מהימן לכסות את המושבה בשלב 1.2, ו - 2) לקצץ את אגר רק בצדדים, לא על את החלק העליון והתחתון, ורק לקצץ מספיק כדי לאפשר לו להשתלב בתוך תבניות בשלב 1.5.

השלב השני של פרוטוקול זה הוא קריטי עבור חלקים אופטימלי כרוכה קשיות של הבלוק של הטבעה בינוני. בדרך כלל אבני נבחנים לאחר דגירה בין לילה, על ידי הסרת אותם תבניות. אם חוסם את עדיין גמישה כאשר החזיק בשתי ידיו מתוחות, הם כנראה לא מספיק חזק עבור חתך. במקרה הזה הם חזרו בחממה בטמפרטורה זהה עבור 48 שעות נוספות להערכה מחדש כאמור לעיל.

המשמעות של להיות מסוגלים לזהות דפוסים של סוגי תאים בתוך מושבות חיידקים היא כי דפוסים אלה עשוי לשקף ארגון פונקציונלי של תאים לתוך קהילות. ואכן, דפוסים של חיידקים עשויים לשקף מנגנונים עתיקים בסיסי שבאמצעותו אורגניזמים מאותו המין אינטראקציה. יחד עם שיטות ניטור דפוסי ביטוי גנים במושבות ^3,6, את היכולת לזהות דפוסים של התמיינות תאים ביישובים אלה יכולים לסייע לבחון מנגנונים פוטנציאל של היווצרות דפוס מיקרוביאלי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	RT 19152
Silicone embedding molds	Fisher Scientific	NC 9975029
Cycloaliphatic epoxide resin	Electron Microscopy Sciences	RT 15004	ERL 4221
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences	RT 13000	DER 736
Nonenyl Succinic Anhydride	Electron Microscopy Sciences	RT 19050	NSA
2-Dimethyl amin–thanol	Electron Microscopy Sciences	RT 13300	DMAE
Mounting media	KPL Inc	71-00-16
Rotating wheel	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Microtome	Leica Microsystems	Ultracut S