Summary
ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.
Abstract
Microarrays de ADN se han convertido en una poderosa herramienta para la detección de patógenos. 1.5 Por ejemplo, muchos ejemplos de la capacidad de escribir y subtipo de virus de la influenza se ha demostrado. 11.6 La identificación y subtipificación de la influenza en microarrays de ADN tiene aplicaciones tanto en público la salud y la clínica para la detección temprana, intervención rápida, y minimizar el impacto de una pandemia de influenza. Fluorescencia tradicionales es actualmente el método de detección de microarrays de uso más común. Sin embargo, como la tecnología de microarrays avanza hacia el uso clínico, una sustitución de instrumentos caros, con tecnología de bajo costo de detección que presentan características de rendimiento similares a la fluorescencia se hacen ensayos de microarrays más atractivo y rentable.
La tecnología de detección colorimétrica ampliPHOX está diseñado para aplicaciones de investigación, y tiene un límite de detección dentro de un orden de magnitud de fluorescencia tradicionales 11, con una ventaja de ser un aproximado de diez veces menor coste en comparación con el instrumento de los escáneres de microarrays confocal de fluorescencia necesaria para microarrays detección. Otra ventaja es el tamaño compacto del instrumento que permite la portabilidad y flexibilidad, a diferencia de los instrumentos tradicionales de la fluorescencia. Debido a que la tecnología de polimerización no es tan intrínsecamente lineal, como la detección por fluorescencia, sin embargo, es el más adecuado para aplicaciones de baja densidad de microarrays en el que se desea una respuesta sí / no a la presencia de una cierta secuencia, por ejemplo, para matrices de detección de patógenos. En la actualidad la densidad de punto máximo compatible con la detección de ampliPHOX es de ~ 1800 puntos / matriz. Debido a las limitaciones de densidad lugar, una mayor densidad de microarrays no son adecuados para la detección de ampliPHOX.
A continuación, presentamos la tecnología de detección colorimétrica ampliPHOX como un método de amplificación de la señal en un microarray de baja densidad para la detección y caracterización de los virus de la influenza (FluChip). Aunque este protocolo utiliza el FluChip (un microarray de ADN) como una aplicación específica de ampliPHOX detección, los microarrays de la incorporación de meta con biotina puede ser etiquetada y se detecta de manera similar. El diseño de microarrays y biotinilación de la meta de ser capturados son responsabilidad del usuario. Una vez que el objetivo de biotina ha sido capturado en la matriz, la detección ampliPHOX se puede realizar mediante el etiquetado de la primera serie con un conjugado de estreptavidina-etiqueta (ampliTAG). Tras la exposición de luz mediante el instrumento ampliPHOX Reader, la polimerización de una solución de monómero (ampliPHY) sólo se produce en las regiones que contienen ampliTAG marcado objetivos. El polímero formado puede ser posteriormente se tiñeron con una solución no tóxica para mejorar el contraste visual, seguido por imágenes y análisis con un paquete de software simple (ampliVIEW). El ensayo FluChip, desde la no-extraídos de la muestra de resultados se puede realizar en unas 6 horas, y las medidas de detección ampliPHOX descrito anteriormente se puede completar en unos 30 min.
Protocol
1. Muestra de amplificación mediante RT-PCR
- Extraer el ARN viral a partir de material clínico o una. Aislado viral con el virus de Qiagen MinElute Kit girar en conjunto con la plataforma automatizada QIAcube extracción de ácidos nucleicos Las extracciones se llevan a cabo en 200 muestras l con un volumen de elución final de 60 microlitros. Extractos de almacenar a -70 ° C o menos para su uso posterior.
- En una plantilla libre de la zona, preparar la mezcla de RT-PCR maestro en el hielo, según el protocolo del fabricante. Para incorporar biotina durante la RT-PCR, utilice una mezcla de dNTP biotinilado en lugar de la mezcla de dNTP suministrado por el fabricante. El costo de utilizar una mezcla de dNTP biotina es menos de $ 1 USD / ensayo. Métodos alternativos de incorporación de biotina como la utilización de una cartilla con biotina también se puede utilizar. Añadir cartilla mezcla a una concentración final de 1,0 M para la gripe A, 1,0 M de la gripe B, y 0,14 M para el control interno. La gripe A primer conjunto amplifica el segmento del gen de la matriz (1032 producto nt) y el conjunto B de imprimación gripe amplifica un segmento de gen no estructural (811 producto nt). Cada conjunto de cebadores FluChip contiene una imprimación con un 5 'grupo fosforilo para facilitar la generación de ADN de cadena sencilla a través de la digestión enzimática con exonucleasa lambda después de PCR. El producto resultante de cadena simple requiere mucho menos tiempo de hibridación que el equivalente de doble cadena y reduce significativamente el tiempo de ensayo general. Una mezcla previamente preparada de estas cartillas, así como el ARN de control interno de la plantilla están disponibles para los investigadores interesados InDevR sobre una base limitada.
- Agitar brevemente y distribución de 18 l de la mezcla maestra en tubos de pared delgada PCR.
- La transferencia de los tubos en hielo a un área de trabajo adecuada para la adición de plantillas, la plantilla y añadir 2 l de cada tubo de reacción.
- Transferencia de tubos PCR de un termociclador y ejecute el siguiente perfil térmico: la transcripción inversa a 50 ° C durante 30 minutos, la inactivación enzimática / activación a 95 ° C durante 15 min, 40 ciclos de PCR de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 años, y 72 ° C durante 1 minuto, y una extensión final a 72 ° C durante 10 min.
2. La hibridación de RT-PCR para microarrays de baja densidad
- Con el fin de generar una sola cadena de ADN para la hibridación FluChip, preparar la mezcla de digestión enzimática mediante la combinación de 1,0 l de enzimas exonucleasa lambda, 2,2 l de tampón de reacción que acompaña, y un 0,8 l de agua libre de nucleasa. Estas cantidades son para una sola muestra, pero puede ser simplemente reducido el número total de muestras para ser digeridos. Extraer muestras del termociclador y añadir 4 l de la mezcla preparada a cada reacción de digerir la cadena fosforilada del producto de PCR. Devolver las muestras para el termociclador y el programa del termociclador a 37 grados centígrados durante 15 minutos seguido de 95 grados centígrados durante 10 minutos para completar la digestión enzimática y los pasos de calor fragmentación.
- Los microarrays de la gripe personalizados utilizados están impresos en láminas de vidrio aldehídos funcionalizados por Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). 5'-amino terminada la captura de secuencias se combinan con un buffer optimizado detectar e impresos a una concentración final de 20 mM (a excepción de la secuencia de control positivo que, además, tiene una modificación 3'-biotina y se vio a una concentración final de 500 nM) . Un contacto no manchar el método utilizado, con un diámetro del punto óptimo de 300 micras y un centro de paso del centro de 700 micras.
- Quitar microarrays de la caja de almacenamiento y aplicar un solo uso de pozos en todo el hibridación de microarrays mediante la eliminación de la lámina protectora y presionar firmemente alrededor del perímetro de bien.
- Colocar los portaobjetos en un recipiente de lavado que contiene 110 ml de agua purificada para un 5 minutos antes de la hibridación de lavado utilizando un agitador orbital a 60-90 rpm. Seca la matriz tocando suavemente un limpiador de tejidos para el borde del pozo y permitiendo que el agua se evacua.
- Combine 22 l de tampón de hibridación 2x con cada uno de los productos fragmentados ssDNA, y una pipeta 40 ml de las soluciones de hibridación en los pozos de microarrays.
- Permita que se desliza en la hibridación en cámara húmeda cerrada durante 60 minutos.
- Eliminar las diapositivas de la cámara de humedad, una breve aclaración matrices con el tampón de lavado D en una botella de enjuague antes de colocar en el estante de diapositivas. Normalmente, el volumen de enjuague de tampón de lavado D es de 2 ml por cada matriz. Coloque la parrilla de diapositivas con diapositivas en un cubo de lavado que contiene 110 ml de tampón A. Wash bin Colocar en un agitador orbital a 60-90 rpm durante 1 minuto.
- Quitar bastidor de diapositivas de tampón de lavado A, brevemente enjuague con el tampón de lavado D, rack de transferencia de diapositivas a un bin que contiene el tampón de lavado B, y agitar a 60-90 rpm durante 5 minutos.
- Seque la matriz en cada diapositiva, y el lugar se desliza en la cámara de secado de humedad en la preparación de medidas ampliPHOX detección colorimétrica.
3. ampliPHOX: etiquetado de los productos híbridos y fichas de calibración con ampliTAG
- Combinar 10 l de ampliTAG, 20 l de tampón ampliTAG 2x, y 10 l de agua purificada para cada matriz para ser procesado. Volúmenes de reactivos puede ser simplemente reducido el número total de muestras. Asegúrese de preparar la mezcla de etiquetado suficiente para dar cuenta de todas las matrices de la muestra y las matrices de calibración necesarias. El número de fichas de calibración necesarios depende de si está realizando una calibración completa (para un nuevo instrumento o nuevo lote de reactivos), o simplemente un instrumento de comprobación. Para una calibración completa, 3 fichas de calibración deben ser etiquetados, y de un cheque de reactivo, a un chip de calibración de un solo deben ser etiquetados. Tenga en cuenta que antes de que las matrices de calibración están etiquetados, deben pasar por la etapa de lavado, antes de la hibridación que se describió anteriormente para los arreglos de la influenza.
- Transferencia de 40 l de mezcla de etiqueta para cada conjunto y permite el etiquetado reacción tenga lugar en una cámara húmeda cerrada durante 5 minutos.
- Lavar inmediatamente matrices con el tampón de lavado D en una botella de enjuague antes de colocar los portaobjetos en una gradilla para portaobjetos. Transferencia de rack en bandeja que contiene 110 ml de tampón de lavado C y agitar a 60-90 rpm durante 5 minutos.
- El uso de un bin segundo lavado con agua purificada, realizar tres caídas sucesivas de agua breve para eliminar los residuos de sal. Seca las matrices tocando suavemente un limpiador de tejidos para el borde de los pozos.
- Los microarrays están debidamente etiquetados con ampliTAG, y el resto del procedimiento de detección ampliPHOX se puede realizar. Fotoactivación y las imágenes de las matrices de etiquetado debe ser completado dentro de 24 horas, y las matrices se pueden almacenar en una caja de la oscuridad hasta su uso.
4. ampliPHOX: calibración, amplificación de la señal, y la imagen
- A su vez ampliPHOX lector y asegúrese de software ampliVIEW está listo para la fotoactivación.
- Determinar el tiempo de fotoactivación óptimo el uso de chips de calibración. Además de la breve introducción que sigue, este procedimiento también se describen en detalle en el Manual de Operación ampliPHOX. Las fichas de calibración contiene una serie de diluciones de una secuencia de control de biotina que se utilizan para optimizar la sensibilidad de la prueba, con el objetivo de maximizar el número de filas de la ficha de calibración que produce una señal positiva según lo determinado por el software.
- Quitar ampliPHY de 4 ° C, permite a la temperatura ambiente, y agitar brevemente para mezclar. Pipeta de 3 l de ampliPHY potenciador en el vial ampliPHY, y agitar bien durante 10 segundos.
- De manera uniforme la transferencia de 40 ml de solución ampliPHY en el microarray y que contiene el ampliTAG marcado amplia, asegurando que no hay burbujas. Cerrar el vial ampliPHY entre cada aplicación. Insertar la diapositiva de microarrays en la bahía de fotoactivación del lector ampliPHOX.
- Para la matriz de la primera calibración, el uso del tiempo de fotoactivación por defecto en el 'Time' caja en el panel izquierdo del software, y haga clic en el verde botón "Inicio" para iniciar la fotoactivación. Una vez terminado, quitar la matriz y enjuague con agua purificada para eliminar el exceso de ampliPHY. Clara la formación de polímeros en algunos de los puntos debe ser visible.
- Permita que los puntos de polímero que se seque durante 2 minutos, luego distribuir dos gotas de ampliRED en la matriz y permiten tinción para continuar durante 2 minutos.
- Luego, enjuague rápidamente microarrays con agua purificada y seca con un pañuelo limpie.
- Introduzca los microarrays en la bahía de imágenes del lector ampliPHOX, y haga clic en el botón "nueva imagen de captura" en la pestaña de imágenes. Una vez fotografiado, ajustar la cosecha y guardar la imagen.
- En la ficha de análisis, seleccione la máscara de chip de calibración y el botón "Auto de colocación" para iniciar el análisis. El software automáticamente se producirá un "Resumen" que muestra los resultados cuantificados. Basándose en estos resultados, el tiempo de fotoactivación tiene 10 segundos para que la matriz de calibración de segundo y se repite el procedimiento.
- Una vez que el tiempo óptimo de fotoactivación se ha determinado, las matrices de la muestra puede ser procesada usando la amplificación de la señal misma imagen y el protocolo utilizado para la calibración de las matrices.
- Una vez que la imagen es capturada por los paneles de la muestra, una máscara para su distribución amplia en particular, como el diseño conjunto de influenza descrito aquí puede ser created.The ampliVIEW software es capaz de realizar análisis automatizado de imágenes y generación de resultados de la gripe de subtipos para cada muestra.
5. Los resultados representativos:
Figura 1. Esquema del método de detección ampliPHOX colorimétrico. (A) ADN diana biotinilado se hibrida con cada punto de la matriz, y (B) marcadas con ampliTAG. (C) ampliPHY solución se añade, y (D) expone a la luz para formar manchas visibles polímero. (E) Los puntos de polímero se forman posteriormente teñidas con un colorante no tóxico para mejorar el contraste.
Figura 2. (A) La influenza de baja densidad de diseño de microarrays. Secuencias de 1-7 y 10-13 de la gripe A de destino, y las secuencias de 8, 9 objetivo de la gripe B. (B) ampliPHOX y (C) imágenes de fluorescencia de una novela de la gripe H1N1 2009 ("gripe porcina") que indiquen el mismo patrón de detección tanto por métodos.
Figura 3. De izquierda a derecha las imágenes, el representante de ampliPHOX para la influenza A H3N2, H1N1 de origen humano, 2009 H1N1 (de origen porcino), y una muestra negativa. Todos los 3 subtipos muestran patrones visualmente distintos en la matriz. Observe en el negativo que sólo el control interno de MS2 se ve, lo que indica la amplificación de RT-PCR no se inhibió.
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Discussion
La tecnología de detección de ampliPHOX colorimétrico que aquí se presenta es una alternativa rápida y económica para la detección de un solo color de fluorescencia para aplicaciones de baja densidad de microarrays. Se muestra esquemáticamente en la Figura 1, el principio de detección se basa en el uso de una etiqueta fotoiniciador (1B). En presencia de una solución de monómero que contiene (1C), exposición a la luz hace que el fotoiniciador (ampliTAG) para desencadenar una reacción de polimerización sólo en las regiones marcadas (1D). Aunque ha demostrado aquí en una matriz de ADN para la identificación de la influenza y la tipificación, la tecnología se puede extender para detectar cualquier producto biotinilado capturado en un microarray. A modo de ejemplo, nuestro trabajo anterior sobre la detección basada en la fotopolimerización con una química diferentes de reactivos se demostró en los dos ácidos nucleicos y las matrices basadas en anticuerpos. 12 Otros también han demostrado una prueba de concepto para las aplicaciones de los anticuerpos y basados en proteínas de un sistema basado en la fotopolimerización . En estos casos, diferentes químicos reactivos que requieren purgar con un gas inerte se utilizaron 13,14.
Un esquema de la influenza de baja densidad de microarrays y de imágenes representativas se puede ver en la Figura 2. Se muestra en la Figura 2A, la matriz contiene un marcador espacial / control de manchas (en rojo) y 14 secuencias de captura única (en azul), cada uno vio por triplicado. Las secuencias de captura son un terminal amino sintético corto (alrededor de 25 mer) oligonucleótidos diseñados para capturar los objetivos de la gripe que son genéticamente representativos de los tipos o subtipos específicos de la influenza. Las secuencias de captura están diseñados para producir patrones muy diferentes en el chip de diferentes subtipos de influenza. Figuras 2B y 2C muestran una comparación directa de la detección de una nueva muestra de 2009 por H1N1 ampliPHOX y fluorescencia tradicionales, respectivamente. El resultado de fluorescencia se ha generado mediante un escáner de fluorescencia confocal de microarrays (Genetix Aquire). El mismo patrón global de detección pueden ser vistos fácilmente por los dos métodos, sin embargo, el resultado ampliPHOX es visible a simple vista.
Muestra en la Figura 3 son los resultados ampliPHOX de la gripe A tres representante de las muestras positivas y negativas, como una muestra procesada por el protocolo descrito aquí. Las figuras 3A, 3B, 3C y los resultados muestran un origen humano, H3N2, H1N1 de origen humano, porcino y de origen-H1N1 (2009 H1N1), respectivamente. Una clara diferencia en el patrón global de detección puede ser visto fácilmente por estas tres imágenes. Por ejemplo, se puede observar que las secuencias 2 y 3 de la señal producen para todos los subtipos de influenza A se muestra (3A-3C), pero que las secuencias de 10, 12 y 13 sólo se produce la señal de origen porcino H1N1-muestra (3C) . Este enfoque ha sido utilizado previamente el tipo de éxito y los virus del subtipo de influenza en un microarray. 6,8,10 Es importante destacar que la muestra negativa se muestra en la figura 3D muestra la señal en la secuencia de control interno, lo que indica que no hay inhibición o el fracaso de la reacción de RT-PCR.
La interpretación de estas imágenes es fácil automatizar el software ampliVIEW. El primer usuario que utiliza el software para definir el diseño de microarrays, y luego de describir los objetivos que deben estar presentes para generar una cierta "respuesta" para este diseño. Por ejemplo, el diseño de la influenza se muestra en la Figura 2A podría generar resultados lógicos, tales como "la gripe A positivo", "la gripe B positivo", "fuera de temporada de la gripe A", "la gripe estacional", y "negativo", según el los resultados deseados. Una vez que estas tareas lógicas son realizadas y guardadas, el software puede interpretar las imágenes para proporcionar un resultado con poca intervención del usuario.
La tecnología de detección de ampliPHOX genera resultados visuales, colorimétricos para microarrays de baja densidad con una sensibilidad similar a la fluorescencia en cuestión de minutos. Creemos que la combinación de fácil de uso, los reactivos de bajo costo con un instrumento de bajo costo ofrece una atractiva alternativa a los métodos tradicionales de detección de microarrays, particularmente en lo más específico, una menor densidad genómica / diagnóstico de microarrays se utilizan cada vez más en una variedad de aplicaciones.
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Disclosures
Todos los autores son empleados de InDevR, Inc., una entidad sin fines de lucro. InDevR está comercializando la tecnología ampliPHOX aquí se describen.
Acknowledgments
InDevR reconoce NIH / NIAID U01AI070276 y R43AI077112 para la financiación de este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
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