Summary
O protocolo a seguir descreve o processo de isolamento, ventilação e instrumentação pulmões do rato para medir estável ou pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações, a fim de quantificar os efeitos do fluxo sanguíneo, o fluxo de ar, alterações das vias aéreas e alterações vasculares no pós-carga do ventrículo direito.
Abstract
O isolado, ventilado e instrumentado preparação de pulmão do rato permite constante e pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relacionamentos para ser medido com controlo independente sobre a taxa de fluxo arterial pulmonar, forma de onda vazão, pressão das vias aéreas e da pressão atrial esquerda. Resistência vascular pulmonar é calculado com base multi-ponto, constante pressão de fluxo de curvas; impedância vascular pulmonar é calculado a partir pulsátil da pressão do fluxo de curvas obtidas em uma faixa de freqüências. Como agora reconhecida clinicamente, impedância é uma medida superior de pós-carga ventricular direita do que a resistência, pois inclui os efeitos da complacência vascular, que não são desprezíveis, principalmente na circulação pulmonar. Três métricas importantes de impedância - o zero hertz impedância Z 0, a impedância característica Z C, eo índice de reflexão da onda R W - fornecer a introspecção em distal área transversal disponível para o fluxo arterial, rigidez arterial proximal e da impedância a montante ea jusante incompatibilidade, respectivamente. Todos os resultados obtidos no isolado, ventilado e pulmões perfundidos são independentes do tônus do sistema nervoso simpático, o estado do volume e os efeitos da anestesia. Temos utilizado esta técnica para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica sobre a resistência e impedância, e para diferenciar entre sítios de ação (ie, proximal versus distal) de drogas vasoativas e doenças usando a dependência da pressão de Z C. Além disso, quando estas técnicas são usadas com os pulmões de linhagens geneticamente modificadas de ratos, os efeitos do nível molecular defeitos na estrutura e função vascular pulmonar pode ser determinada.
Protocol
Neste protocolo, demonstramos um isolado, ventilado, preparação de pulmão perfundido de rato que tenha sido utilizado para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica em pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações (Tuchscherer, Webster, e Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). Em breve, os pulmões do rato são cirurgicamente isolada dos tecidos adjacentes, colocados em uma câmara climatizada (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) e ventilado (Módulo de Controle Ventilatório (VCM)-R com timer módulo contador (TCM); Harvard aparelhos). A vasculatura pulmonar é perfundido com aquecida meio de cultura RPMI 1640 celular com Ficoll 3,5% usando uma bomba de seringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) para gerar o constante fluxo de formas de onda ou uma bomba de alta freqüência oscilatória (Bose-Electro Force, Eden Prairie, MN) em paralelo com a bomba de seringa para criar pulsátil de fluxo vascular pulmonar formas de onda. Transdutores de pressão (P75, Aparelho Harvard) medir a pressão da artéria pulmonar instantânea (PAP) ea pressão atrial esquerda (PAE). Vazão instantânea (Q) é medido com um medidor de fluxo de in-line (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos são derivados a partir dessas medições, que fornecem insights sobre vascular pulmonar fisiologia e patologia e pós-carga do ventrículo direito.
1. Equipamento:
- Pulmão isolado set-up, incluindo ventilador do mouse
- Sistema de aquisição de dados e computador com programa LabView
- Dois transdutores de pressão e medidor de vazão para o fluxo de perfusato
- Transdutor de pressão e medidor de vazão (pnemotachometer) para o fluxo das vias aéreas
- Bomba de alta freqüência oscilatória e computador com Win programa de teste
- Lança / zoom microscópio da lâmpada,
- Banho de aquecimento com bomba de alto débito para o sistema IL-1
2. Preparando o sistema IL-1
- Água destilada aquecida a 37 ° C por banho de aquecimento é distribuída para o interior da IL-1 do sistema.
- Todas as bombas, e transdutores a IL-1 cânula são conectados através de tubos limpos e toda a tubulação é lavada com água destilada aquecida a 37 ° C. Bolhas de ar, o que poderia viajar para o pulmão e causar edema, deve ser removido. Tubulação da bomba de fluxo oscilatório para o sensor de fluxo e do sensor de fluxo para a cânula da artéria pulmonar são lavados com PBS 1%.
- O P75 transdutores de pressão são zerados, fechando a válvula para a cânula, a abertura das válvulas para a atmosfera e, em seguida, apertar o botão automático de zero do amplificador PLUGSYS. Então, a válvula para a atmosfera é fechada ea válvula para a cânula aberto.
- A peça de cerâmica porosa na via de ventilação do sistema de IL-1 é molhada para fornecer umidade.
3. Soluções
- Prepare 3,5% por volume de solução de Ficoll-RPMI filtro estéril e os meios de comunicação. Filtragem a mídia garante que não haja grandes partículas que poderiam involuntariamente embolize o pulmão. Usando meios estéreis também reduz a probabilidade de edema súbito desenvolvimento no pulmão. Preencher uma seringa de 10 ml com RPMI para cirurgia e uma seringa de 60 ml com RPMI para cada ensaio experimental. Aqueça o perfusato a 37 ° C banho-maria.
- Prepare 1ml de peso corporal heparina 500IU/100g do mouse (aproximado). O sal de heparina é 158IU/mg. Para um rato g ~ 25, mix 1,25 mg de sal heparina com 1ml solução PBS em um tubo de microcentrífuga de pequeno porte.
4. Ventilar um rato
- Após uma injeção intraperitoneal de pentobarbital 150 mg em solução por quilograma para o mouse, garantir a anestesia profunda, realizando uma pitada rígido em uma pata. Se não houver reação, preparar o mouse para a cirurgia fixando suas patas da frente para corkboard para a estabilidade. Nota: Durante todo o experimento profundidade anestésica é monitorado observando cuidadosamente o animal. Os pinos nas patas e incisões freqüentes atuar como estímulos nocivos, a falta de resposta a que confirma que o animal permanece em um plano cirúrgico de anestesia.
- Pulverizar o peito com álcool a 95% para molhar as de pele e utilize uma pinça reta para agarrar a pele no pescoço. Corte de 1 cm de abertura na pele com a tesoura reta.
- Uma vez que o interior do gargalo está exposta, remover todo o tecido glandular e músculo branco superficial, olhando para o esôfago e traquéia. Isolar o esôfago e traquéia do tecido em ambos os lados e posteriormente.
- Inserir a pinça pequena dobrada sob a traquéia e pegar um pedaço de fio do outro lado. Puxe a sutura sob a traquéia e dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó.
- Um pequeno corte em ângulo "v" na traquéia com uma tesoura pequena, não cortar todo o caminho através da traquéia. Mover a placa da cortiça e do rato para a IL-1 aquecida sistema. Usando as duas pinças blunt, pegue a cânula traqueal e da traquéia abaixo do "v". Então, deslize a cânula traqueal no tracheA através do "v" de abertura. Aperte a sutura em torno de traquéia e cânula traqueal para garantir a cânula dentro da traquéia. Amarrar o nó.
- Iniciar ventilação (inspiração de 50%, 90 respirações / min, com a inspiração profunda) com ar ambiente.
5. Perfusão um rato ventilado
5.1. Acessar o ventrículo direito para injetar heparina
- Pulverizador do peito do rato com álcool novamente para re-molhar a pele. Retire toda a pele no peito acima das costelas com a pinça em linha reta e tesoura reta. Corte para cima ao longo do esterno. Levante a pele em cada lado e depois cortar a pele, seguindo a linha das costelas inferiores.
- Compreender o processo xifóide, na parte inferior do esterno com uma pinça e cortar um buraco no diafragma usando a tesoura reta. Agarre o diafragma com a pinça e corte-o longe das costelas.
- Compreender o processo xifóide novamente com a pinça (mão esquerda) e use a bola ponta, tesoura angulada para cortar o esterno e costelas por meio, tomando cuidado para não cortar os pulmões, coração ou dos vasos sanguíneos (use a bola ponta-on a tesoura para guiá-lo). Haverá sangue, mas desde que a ponta da tesoura é contra o esterno, o coração e os pulmões não será cortado.
- Segure as costelas do lado esquerdo e cortar o máximo de costelas, conforme necessário para expor o coração. Injecte lentamente o ventrículo direito com 0,1 ml solução de heparina. Este passo é importante para prevenção de coágulos de sangue no pulmão, que danificam as células endoteliais e irá prejudicar a perfusão. A heparina deve ser injetado enquanto o coração ainda está batendo.
5.2. Canular a principal artéria pulmonar
- Cortar o resto das costelas (lado esquerdo e direito), usando as costas (arredondado) final do fórceps para empurre os pulmões de distância da parede torácica. Agarrando os pulmões se irá danificar o tecido delicado. Contato acidental entre as pontas de tesoura eo tecido pulmonar também irá causar danos.
- Mover o microscópio no lugar sobre pulmão. Cortar o tecido glandular e gordura na parte superior do coração. Use a pinça para retirá-lo longe das artérias e veias e depois corte com a tesoura primavera, enquanto o tecido é em tensão.
- Usando um outro conjunto de pinças blunt, colher da direita para a esquerda da parte superior do coração sob átrio esquerdo / ventrículo para chegar a ponta da pinça sob a aorta ea artéria pulmonar (PA). Faça isso com cuidado, não deve haver resistência para as pinças. Usando uma pinça sem corte reduz a probabilidade de acidentalmente punção da artéria pulmonar ou aorta.
- Uma vez que a ponta pinça está sob a aorta e AP, pegue um pedaço de sutura e sobreviver. Dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó.
- Opcional: use a tesoura angulada para remover a metade inferior do corpo. Cortar através das costelas e coluna vertebral; corte a aorta ea veia cava fará com que uma quantidade significativa de sangue flua - use um Q-dica para estancar o fluxo. Coloque em um saco para descarte.
- Primeiro-PA cânula com 4 ml de uma seringa de 10 ml de RPMI. Verifique se toda a tubulação está livre de bolhas de ar. Perfusão do pulmão com água destilada ou bolhas resultará em edema.
- Corte um pequeno entalhe na parede livre do ventrículo direito e inserir a cânula PA, que aponta para baixo e à direita. A ponta da cânula deve ser visível através da parede transparente do PA. Infundir uma pequena quantidade de RPMI para confirmar a sua localização. Aperte a sutura ao redor da cânula aorta, e PA e amarrar o nó. Note que, neste ponto, a aorta também é amarrado para perfusão real não deve começar até o átrio esquerdo canulado é.
5.3. Canular o átrio esquerdo
- Corte um entalhe na parte inferior do ventrículo esquerdo e inerte do átrio esquerdo (LA) cânula, visando cima. Leve pressão pode ser necessário para abrir a válvula mitral nessa direção. No local correto, a ponta da cânula vai escorregar completamente e ser seguro, sem sutura.
5.4. Comece a perfusão
- Manualmente infundir RPMI da seringa de 10 ml a 0,3 ml por minuto até RMPI é evidente na tubulação de saída (rosa-ish cor em contraste com o PBS claro). Se não há fluxo na saída de tubulação, re-posição da cânula LA. Se nenhuma saída pode ser obtida com re-posicionamento, verifique se há um vazamento na artéria pulmonar. Um vazamento ou ruptura na artéria pulmonar não pode ser reparado, o que é motivo para abortar o experimento.
- Conecte uma seringa de 60 ml para a cânula PA através da IL-1 do sistema e começar a infusão 1mL/min de perfusato, verificação de vazamentos e certificando-se nos pulmões ficam brancos, o que mostra que RPMI está substituindo o sangue nos pulmões. Perfundir com fluxo lento por dois minutos.
6. Medição pulsátil e constante pressão pulmonar Fluxo de Relacionamentos
- Para os estudos de fluxo pulsátil, primeiro defina os deslocamentos de pistão oscilatório bomba emos níveis desejados para cada freqüência na WinTest programa baseado em experiências anteriores. Variabilidade devido na estrutura pulmonar e mecânica, os deslocamentos devem ser ajustados para cada rato. Definir fluxo constante para o nível desejado. Abra a válvula na bomba oscilatório e começar a gravação de dados direito antes de executar o perfil de fluxo oscilatório (programa Wintest). Abra o arquivo de dados e traçar o fluxo experimental (Q) em Excel. Ajuste os deslocamentos de pistão oscilatório bomba em cada frequência (programa Wintest) de modo que Q e Q max min são tão desejado.
- Para ensaios de fluxo constante, fechar a válvula na bomba oscilatório. Se essa válvula é deixada aberta, a bomba oscilatório age como um capacitor, amortecendo as mudanças de uma taxa de fluxo para o outro. Coletar dados para pelo menos 10 segundos a cada taxa de fluxo ou até que a pressão PA não muda por mais de 5%.
- Para medições de vazão ou pulsátil ou contínuo, ventilação velhos a uma pressão constante antes da coleta de dados. Retomar a ventilação imediatamente após a coleta de dados.
- Preste atenção para RPMI na tubulação das vias aéreas, isto é evidência de edema e é motivo para abortar o experimento. Além disso, não deixe RPMI atingir a pressão das vias aéreas ou sensores de fluxo, pois irá danificar os transdutores.
7. Resultados representativos:
Resultados representante constante:
No pulmão isolado set-up o pesquisador tem a capacidade de controlar de forma independente, não só o fluxo pulmonar Q mas também as vias aéreas pressão P do ar e deixou LAP pressão atrial. Isto é vantajoso porque Q, P ar e LAP influenciar a vasculatura pulmonar e consequente PAP pressão da artéria pulmonar. Outra vantagem é que os resultados obtidos são independentes do tônus do sistema nervoso simpático 1, status de volume e anestesia 2.
PAP alterações induzidas pela escada-Q para mudanças na fixa P ar e fixa ou variável LAP são mostrados na Figura 1. Note-se que na preparação de pulmão isolado, a cânula LAP está normalmente ligado ao tubo que direciona o perfusato em um recipiente de resíduos. Com este tubo no lugar, LAP é linearmente dependente Q devido ao fluxo de Poiseuille. No entanto, a altura da tomada e recipiente de resíduos pode ser ajustado manualmente para fornecer uma constante, LAP não-zero ou a tubulação pode ser removido para permitir de zero LAP que é independente de Q.
Representante Resultados pulsátil:
Enquanto arbitrária pulsátil do fluxo de onda pode ser gerada com este sistema, que normalmente geram fluxo da forma Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min, nas freqüências de f = 1, 2, 5, 10, 15 e 20 Hz para avaliar a impedância linearizada da vasculatura pulmonar (Figura 2: painel superior). A partir das medições resultantes LAP PAP, e Q, magnitude da impedância vascular pulmonar (Z) e fase (θ) são calculados pela primeira decomposição um ciclo completo da AP sinusoidal = PAP LAP-Q e em cada frequência sinusoidal taxa de fluxo de impostos em uma série de harmônicos sinusoidal usando uma transformada de Fourier. A relação da pressão de transformar a fluir rendimentos transformar a impedância vascualar pulmonar, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), que tem magnitude Z e fase θ. Impedância de entrada Z 0, impedância característica Z C, e índice de reflexão da onda R W, são calculados a partir da magnitude da impedância. Em particular, Z 0 é calculado a partir de Z a 0 harmônica (f = 0 Hz), calculados sobre todas as freqüências, Z C é calculada como a média de Z entre o mínimo primeiro (5 Hz) e 20 Hz, e R W é calculado como (Z-Z 0 C) / (Z + Z 0 C) 3.
Figura 1 constante fluxo de formas de onda (linha superior) e as pressões resultantes. (Segunda linha: PAP, P ar, LAP) em função do tempo com diferentes combinações de LAP e ar P. A linha inferior mostra PAP vs P. Em (A) e (B), aumenta e diminui com LAP Q porque a tubulação de saída foi no lugar. Esta tubulação foi removido para (C) de modo que LAP é constante e independente de P. Em (D) e (E) a altura da tubulação de saída foi ajustada manualmente para que LAP é maior, mas independente do Q. P ar era tanto a inspiratório final (A, C, D) ou pressão expiratória final (B, E).
Figura 2 fluxo pulsátil forma de onda Q (painel superior) e as pressões resultantes (painel inferior: PAP LAP, e P ar). Como uma função do tempo. A partir dessas pulmonar pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos, PVZ pode ser calculado, o que reflete a pós-carga ventricular total direita.
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Discussion
Etapas críticas na cirurgia
É fundamental que se tenha o cuidado ao cortar a caixa torácica longe dos pulmões. Os pulmões devem ser completamente expostos e desinibida por tecidos em volta durante a inflação, mas não danificada durante o processo de isolamento. O uso de um objeto liso como o back-end da pinça pode ser usada para manter os pulmões de distância da parede torácica para que haja um caminho claro para a tesoura para cortar. Outro passo fundamental é a colocação da sutura ao redor da artéria pulmonar e aorta. Usando uma pinça blunted reta irá reduzir o risco de punção da artéria pulmonar. A última etapa crítica durante a cirurgia é a colocação das cânulas. Se as cânulas são demasiado elevados acima do plano dos grandes vasos como eles saem do coração, as cânulas pode puxar em cada artéria pulmonar ou veias pulmonares. Se a cânula no átrio esquerdo é muito baixo, ele pode bloquear o fluxo para o pulmão esquerdo. Como conseqüência, mais o fluxo vai para o pulmão direito, aumentando PAP e acelerando o desenvolvimento de edema no pulmão direito.
Etapas críticas durante a coleta de dados
Constante fluxo de coleta de dados deve ser realizada rapidamente, especialmente para altas taxas de fluxo, de modo que a exposição da vasculatura pulmonar para tensões de cisalhamento alta fluido é minimizado. Em nossa experiência, de alto cisalhamento tensões levar a edema pulmonar. Além disso, o rápido aumento na tensão de cisalhamento pode causar edema pulmonar. Para condições de fluxo constante, um aumento no fluxo de 6 ml / min / min não causa edema. Taxas de fluxo constante ao longo de 5 ml / min pode ser obtida sem edema em determinadas condições. Temos os pulmões perfundidos de controle e de ratos cronicamente hipóxicos com taxas de fluxo constante tão alto quanto 10 ml / min com sucesso.
Limitações de freqüência
A maior freqüência testada por nós é tipicamente 20 Hz porque usamos um fluxo de onda Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min. A bomba que descrevemos aqui pode gerar oscilações em freqüências mais altas (pelo menos 50 Hz), porém o trade-off é reduzido comprimento do curso, ou seja, mudança na forma de onda de fluxo Q. A mais fisiológico em que a magnitude da oscilação de fluxo diminui com freqüência cada vez maior poderia provavelmente ser simulado com este sistema. Alternativamente, uma bomba de perfusão personalizado pode ser usado com o mesmo isolamento cirúrgicas e procedimentos de ventilação descrito aqui. A faixa de freqüência dos transdutores de pressão (P75, Harvard Apparatus, Holliston, MA) é relatado como 0-100 Hz. A resposta de freqüência real dos transdutores é dependente da rigidez eo tamanho do tubo utilizado para conectar os transdutores para o PA e cânulas LA. Usando tubos de metal em vez de tubos de polietileno aumentaria a resposta do sistema. Contudo, não é possível usar completamente tubulação rígida porque a flexibilidade na cânula localização e posicionamento são necessários durante a cirurgia. No entanto, transdutores de maior freqüência de resposta e / ou mais tubos rígidos aumentaria o sinal-ruído nas medidas de pressão e permitir PVZ a ser obtido nas freqüências mais altas.
Aplicações
Esta preparação pulmão isolado tem sido usado para investigar o efeito de 4 de embolia pulmonar crônica, bem como 5 em hipóxia pulmonar pulsátil da pressão do fluxo de relações. Ele também foi usado para investigar os efeitos de drogas vasoativas na circulação pulmonar 6 e quantificar o proximal e distal pulmonar aguda efeitos vasculares da inibição da quinase rho 7. Esta técnica pode ser utilizada para quantificar a fisiologia vascular pulmonar em linhagens puras ou outbred de ratos ou camundongos geneticamente modificados 8. A interpretação dos dados de pressão de fluxo obtidos com esta preparação pulmão isolado não é complicada pelas diferenças no ritmo cardíaco ou débito cardíaco entre linhagens de camundongos. É importante notar que os espectros de impedância obtidos em um isolado, ventilado pulmão perfundido em resposta a uma forma de onda não-fisiológicas não devem ser directamente comparados com os obtidos em um em preparação vivo em resposta a um batimento cardíaco normal. Além disso, in vivo, a ventilação é pela negativa, não de pressão positiva, e da viscosidade do sangue é de aproximadamente 4 vezes a viscosidade de RPMI com Ficoll.
Significado
Usando o isolado, ventilado, preparação de pulmão perfundido de rato, temos sido capazes de mostrar que células de músculo liso de ativação por inibição rho-quinase aguda não tem efeito direto sobre o cumprimento das grandes artérias, canal que significativamente pós RV impacto 7. A importância clínica do cumprimento da artéria proximal tem sido cada vez mais reconhecida 9-11. Além disso, redução da complacência da artéria pulmonar principal foi mostrado para ser um excelente indicador de mortalidade na hipertensão arterial pulmonar 10,11. A principal causa da DEATh de hipertensão pulmonar é falência ventricular direita, no entanto o aumento da pressão média da artéria pulmonar por si só não é suficiente para causar a falha 12. A medida mais eficaz de pós-carga ventricular total direito é PVZ, que depende tanto do cumprimento proximal e resistência distal e é calculado a partir pulmonar pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos, como pode ser obtido no pulmões do rato com este protocolo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health conceder R01HL086939 (NCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 10 ml syringe | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| 60 ml syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| RPMI with GLN 6/PK | Fisher Scientific | MT10040CV | |
| Bottle Top Filters | Fisher Scientific | 09-761-57 | |
| Ficoll PM 70 | Sigma-Aldrich | F2878-100g | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | ||
| Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Angled Ball Iris scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 4mm Blades | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine Iris Scissors - straight | Fine Science Tools | 14106-09 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont Medical Biology Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lauda E100 ECO-line 003 | VWR international | Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922 | |
| IL-1 Isolated perfused mouse lung system | Harvard Apparatus | 739904 | |
| Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Harvard Apparatus | 730020 | |
| TS410 Flow Modules | Transonic | TS410 | |
| ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors | Transonic | ME 4 PXN | |
| Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps | Cole-Parmer | EW-74900-20 | |
| Nembutal 50MG/ML 20ML Vial | Amatheon |
References
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