Summary
Een algemeen protocol voor de studie van de invasie van gastheercellen door een bacteriële ziekteverwekker, gericht op
Abstract
Hier zullen we beschrijven hoe we de invasie van menselijke endotheelcellen studie van bacteriële ziekteverwekker Staphylococcus aureus. De algemene protocol kan worden toegepast op de studie van de cel invasie door vrijwel alle kweekbare bacterie. De stadia waarin specifieke aspecten van de invasie kan worden bestudeerd, zoals de rol van actine herschikking of caveolae, wordt gemarkeerd. Gastheercellen worden gekweekt in kolven en wanneer klaar voor gebruik zijn gezaaid in 24-well platen die Thermanox dekglaasjes. Met behulp van coverslips maakt latere verwijdering van de cellen van de putten om interferentie te verminderen van serumeiwitten afgezet op de zijkanten van de putten (om S. aureus, die zou hechten). Bacteriën zijn uitgegroeid tot de vereiste dichtheid en gewassen om eventuele uitgescheiden eiwitten (bijvoorbeeld toxinen) te verwijderen. Coverslips met samenvloeiing lagen van endotheelcellen zijn overgebracht naar nieuwe 24-well platen met vers kweekmedium voor de toevoeging van bacteriën. Bacteriën en cellen worden dan geïncubeerd samen voor de benodigde hoeveelheid tijd in 5% CO 2 bij 37 ° C. Voor S. aureus is dit meestal tussen de 15-90 minuten. Thermanox dekglaasjes worden verwijderd uit elk putje en dip-gewassen in PBS om losse bacteriën te verwijderen. Als de totale geassocieerde bacteriën (hechtende en geïnternaliseerd) moeten worden gekwantificeerd, zijn dekglaasjes dan geplaatst in een frisse putje met 0,5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetteren leidt tot cel-lysis compleet en bacteriën worden opgesomd door de seriële verdunning en beplating op agar. Als het aantal bacteriën die zijn binnengedrongen in de cellen nodig is, worden dekglaasjes toegevoegd aan de putjes die 500 ul weefselkweek medium aangevuld met gentamicine en incubatie gedurende 1 uur, dat zal doden alle externe bacteriën. Coverslips kunnen vervolgens worden gewassen, cellen gelyseerd en bacteriën worden opgesomd door uitplating op agar zoals hierboven beschreven. Als het experiment vereist directe visualisatie, kan dekglaasjes worden gefixeerd en gekleurd voor licht, fluorescentie of confocale microscopie of vervaardigd voor elektronenmicroscopie.
Protocol
Het volgende protocol beschrijft de studie van de endotheelcellen invasie van S. aureus, maar kan theoretisch worden gebruikt om cellulaire invasie studie door een kweekbare bacterie. Stages die specifiek zijn voor S. aureus en endotheelcellen worden aangegeven.
1. Voorbereiding van de bacteriën
- Cultuur S. aureus stammen voor 4-16 uur (afhankelijk van de gewenste groei-fase) in 10 ml Brain Heart Infusion-(BHI) bouillon bij 37 ° C in lucht met schudden bij 200 rpm. Deze groei voorwaarden zijn specifiek voor S. aureus en moet mogelijk worden aangepast voor andere bacteriën.
- Was bacteriën drie keer in Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM, Invitrogen) door plaatsvervangers rondes van centrifugatie bij kamertemperatuur (5000 x g, 10 min), het verwijderen van de cultuur supernatant en resuspensie van de bacteriële pellet in een equivalent volume van DMEM. Meet de optische dichtheid van de resulterende suspensie van bacteriën, die vervolgens kunnen worden aangepast als nodig is. Voor S. aureus, bereiden we een schorsing bij OD 600 = 1, wat overeenkomt met ~ 10 9 kve ml -1.
2. Endotheelcellen Cultuur
- Cultuur van de endotheelcellen lijn EA.hy926 een in DMEM aangevuld met foetaal bovine serum (FBS, 10%) en L-glutamine (2 mm) bij 37 ° C in 5% CO 2. Als alternatief kan gepoolde primaire humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) te koop bij Lonza (Basel, Zwitserland) en gekweekt in endotheliale basaal medium aangevuld met 2% FBS, runderen hersenen extract (inclusief heparine), humane endotheliale groeifactor en hydrocortison op 37 ° C in 5% CO 2 volgens de instructies van de fabrikant (Lonza). Deze groei voorwaarden zijn specifiek voor deze cellen en moet mogelijk worden aangepast voor andere gastheercel types.
- Groeien endotheelcellen in T75 flesjes te vullen confluentie, geverifieerd door het oog.
- De voorbereiding van de 24-well platen voor het inbrengen van de dekglaasjes. Fijn pincet (vlam gesteriliseerd) zijn nodig om de dekglaasjes, die een ondoorzichtig en een glanzend oppervlak hebben bewegen. Plaats dekglaasjes in de putjes van de 24-well plaat met de ondoorzichtige oppervlak naar boven om celhechting mogelijk te maken.
- Bevrijd cellen van de T75 kolf met 3 ml trypsine-EDTA (0,25%) en toevoegen aan 10 ml van de desbetreffende kweekmedium.
- Voeg 500 ul van de geresuspendeerde cellen om 24-well platen die Thermanox glas dekglaasjes. Een T75 confluente fles van cellen voldoende cellen voor twee 24-wells platen, wat resulteert in ongeveer 5 x 10 5 cellen per well (in 500 ul medium).
- Incubeer de platen gedurende 48 uur zoals hierboven beschreven, en controleer of cellen van 100% confluentie door omgekeerd lichtmicroscopie.
- Dip-wash dekglaasjes in PBS en toe te voegen aan nieuwe 24-well platen met 490 ul DMEM met 10% FBS in elk putje.
- Om te onderzoeken de rol van specifieke metabole processen in de cel invasie, kan remmers worden toegevoegd aan de gekweekte cellen een uur voorafgaand aan de toevoeging van bacteriën en concentraties gehandhaafd tijdens de test. Bijvoorbeeld, om de rol van actine herschikking in S. bepalen aureus invasie van endotheelcellen, kan 50 uM cytochalasine D worden toegevoegd, of voor de rol van caveolae, 5 mM methyl-β-cyclodextrine kan worden toegevoegd.
3. Invasie Assay
- Voeg 10 ul van gewassen bacteriën (resulterend in ongeveer 2 × 10 7 cfu ml-1 S. aureus) aan elk putje met een dekglaasje aan gewassen met een confluente laag van endotheelcellen in 490 ul DMEM met 10% FBS.
- Incubeer gedurende 15-90 minuten bij 37 ° C in 5% CO 2.
- Voor het meten van het totale aantal bacteriën geassocieerd met de cellen (hechtende en geïnternaliseerd), dip-wash de dekglaasjes drie keer in PBS en toe te voegen aan verse putjes die 500 ul 0,5% Triton X-100 in PBS. Om ervoor te zorgen de cellen volledig te lyseren en laat al de geïnternaliseerde bacteriën, pipet het meerdere malen, wijzend de punt van de pipet rechtstreeks op het oppervlak van het dekglaasje.
- Inventariseer de bacteriën door de beplating vloeibare suspensie (of verdunningen van deze waar nodig) op het oppervlak van TSA platen. Aangezien de TX-100 zal lyseren van een groot aantal Gram-negatieve bacteriën, kan saponine in plaats daarvan 2 worden gebruikt.
- Voor het meten van het aantal geïnternaliseerde bacteriën, verwijder de kweeksupernatant van elk putje met ongebonden bacteriën en te vervangen door 500 ul DMEM/10% FBS, aangevuld met 200 ug ml-1 gentamicine. We routinematig gebruik van gentamicine in plaats van lysostaphin hier zoals het is goedkoper en laat ons toe om tussen de experimenten met verschillende soorten bacteriën (zoals stafylokokken en Lactococci) switch zonder de experimentele protocol te wijzigen.
- Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO 2 gedurende 60 minuten aan alle extracellulaire bacteriën te doden.
- Was coverslips drie keer in PBS,lyseren en sommen door uitplating op TSA zoals beschreven voor de hechting assay hierboven.
- In sommige gevallen kan het de voorkeur om visueel tellen het aantal bacteriën met behulp van licht microscopie. In dit geval, en specifiek voor S. aureus cel invasie, gebruik lysostaphin (10 ug ml-1) in plaats van gentamicine om fysiek te vernietigen de extracellulaire bacteriën.
- Incubeer coverslips voor 20min bij 37 ° C in CO 2 in de lysostaphin oplossing, daarna afspoelen en bevestig met Cytopath (Cellpath).
- Flood de dekglaasjes met crystal violet (0,5%, w / v) voor 5min.
- Dip-spoelen in water, lucht drogen en monteren op glas dia's. Het aantal bacteriën per mm 2 die confluente endotheelcellen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van lichtmicroscopie.
4. Representatieve resultaten:
Expressie van fibronectine-bindende eiwitten (FnBPA en FnBPB) op het oppervlak van S. aureus geeft de mogelijkheid om endotheelcellen binnen te vallen. Recent werk heeft opnieuw de fibronectine-bindende domein van FnBPA 3. Wild-type (WT) S. aureus 8325,4 binnendringt endotheliale cellen met een hoog rendement, terwijl een stam ontbreekt zowel FnBPA en B (Δ FNB) toonde significant verminderd niveau van internalisering (Figuur 1A). Complementeren van de mutant met een plasmide coderend voor FNB A minus de fibronectine-bindend domein (pFnR0) niet bevorderen invasie (Figuur 1A). Daarentegen aanvulling van de mutant met een plasmide dat codeert voor het gehele FNB A gen (pFnBA4) gerestaureerd invasie aan WT niveaus (figuur 1A).
De rol van de FnBPA in endotheelcellen invasie kan ook worden aangetoond met behulp van de heterologe expressie gastheer Lactococcus lactis. Expressie van plasmide-gecodeerd zijn FnBPA in L. lactis (pRM9 9) had geen significante verbetering van hechting op de endotheliale cellen in vergelijking met bacteriën hadden geen FnBPA (CTL) (open bars, figuur 1B). In tegenstelling FnBPA expressie L. lactis endotheelcellen binnengevallen op een beduidend hoger niveau dan de niet-expressie stam (gesloten bars, figuur 1B).
Experimenten werden uitgevoerd vier keer in duplo en de gemiddelde ± standaarddeviatie wordt gepresenteerd. * Vertegenwoordigen gegevens die statistisch significant verschillend (p = <0,05) van WT of CTL waarden.
Figuur 1. Invasie van EA. Hy926 endotheliale cellen door S. aureus (A) of L. lactis (B).
Discussion
De test we beschrijven is gebaseerd op de gentamicine protectie-analyse, die veelvuldig gebruikt om de invasie van gastheercellen studie door bacteriën. Waarnemingen van het onvermogen van gentamicine en andere antibiotica om intracellulaire bacteriën te doden werden gebruikt in het begin van studies over de invasie van gastheercellen door bacteriën 4-8. Het gebruik van 24, 48 of zelfs 96-well platen maakt het genereren van grote hoeveelheden kwantitatieve, reproduceerbare gegevens in een korte tijd en tegen relatief lage kosten. De test is ook aantrekkelijk omdat het vereist geen speciale apparatuur, het kan worden aangepast aan de slag met verschillende bacteriën en cellen, en kan worden gebruikt om de rol van zowel de bacteriële en gastheercel processen in invasie 9 te bestuderen. Inderdaad, sinds de eerste experimenten, heeft de gentamicine bescherming test op grote schaal gebruikt om de gastheercel invasie te meten door een reeks van verschillende bacteriën, of zelfs combinaties van bacteriën 10,11. Terwijl de basisprincipes zijn hetzelfde, vele subtiele variaties in de methode zijn gemeld. In dit artikel hebben we beschreven onze versie en gaf aan waar aanpassingen nodig kunnen zijn voor andere bacteriën of gastheercellen. Bij het ontwerpen van een experiment om gastheercel invasie behulp van deze aanpak zijn er een aantal belangrijke punten om te overwegen te meten:
Bacteriële gevoeligheid voor gentamicine. Dit lijkt vanzelfsprekend, maar het is belangrijk ervoor te zorgen dat de bacterie wordt bestudeerd is gevoelig voor gentamicine bij de concentratie, temperatuur en over de tijdsduur om te worden gebruikt. In het geval van ongevoeligheid, kan het mogelijk zijn om gebruik van andere antibiotica 5. Een alternatieve benadering kan zijn om lytische enzymen (lysostaphin, mutanolysin, lysozyme) 12 te gebruiken.
Incubatie-en inoculum. Bij het uitvoeren van deze test voor de eerste keer is het van belang om vast te stellen de optimale incubatietijd en bacterieel inoculum moet worden gebruikt. Daarom moeten de eerste experimenten te onderzoeken zowel de adhesie en invasie na verloop van tijd (5 minuten tot maximaal 6 uur). Het is ook belangrijk om te beoordelen hoe invasie wordt beïnvloed door de veelheid van infectie (MOI, het aantal bacteriën per cel). In het algemeen is het het beste om zo weinig mogelijk aantal bacteriën mogelijk gebruik omdat dit schade aan de gekweekte cellen te verminderen. Belangrijke verschillen tussen de stammen kunnen worden gemist in geval van verlenging incubatieperiode of grote inocula worden gebruikt 9,13.
Cellulaire schade. Het is belangrijk om voorafgaand wassen bacteriën te gebruiken. Echter, is cellulaire schade niet beperkt tot de toxine productie. Bacteriële invasie, kan inductie van apoptose en verstoring van de normale celfuncties alle oorzaken cellulaire schade. Dit kan leiden tot penetratie van gentamicine in de cel, het doden van geïnternaliseerde bacteriën en geven de indruk dat invasie niet heeft 14 plaatsgevonden.
Incubatie omstandigheden. De temperatuur en de samenstelling van het kweekmedium kan een aanzienlijke impact hebben op de invasie. Bijvoorbeeld invasie van HeLa cellen door Streptococcus pyogenes is afhankelijk van de aanwezigheid van oplosbare fibronectine, die doorgaans aanwezig is in serum 15. Een andere overweging is de groei van bacteriën in het kweekmedium in de loop van het experiment.
Cultuur en de kwantificering van intracellulaire bacteriën. Hoewel de TX-100 niet kan intracellulaire bacteriën te doden, kan het remmen hun groei. Als zodanig is het belangrijk om bacteriële replicatie controleert op vaste media in de aanwezigheid van het reinigingsmiddel. Waar aangetast, kan het mogelijk tot lagere concentraties van het wasmiddel te gebruiken of een alternatief zoals saponine gebruik. Een voordeel van de gentamicine protectie-analyse over de kristalviolet kleuring en microscopie test is dat het minder arbeidsintensief, en het laat de detectie en differentiatie van sub-populaties van geïnternaliseerde bacteriën. Bijvoorbeeld, S. aureus kan produceren ofwel een normale kolonie type (NCT) of de kleine kolonie variant (SCV) 16, die niet te onderscheiden door de microscopie van de afzonderlijke bacteriële cellen. Een voordeel van het kristal violet kleuring en microscopie test over de bescherming van gentamicine test is cel klonteren kan worden verantwoord en dat de intracellulaire bacteriën die een 'levensvatbaar, maar niet-kweekbare' state zal worden gedetecteerd 17 in te voeren.
Het onderzoeken van de rol van de gastheercel processen in de bacteriële invasie. Vele studies hebben ingezet remmers van de gastheercel functie zoals cytochalasine D, die interfereert met actine herschikking. Dergelijke studies kunnen ook antilichamen die zich richten op het celoppervlak receptoren en siRNA knock-down van specifieke genen 18. Het is van vitaal belang om ervoor te zorgen dat deze behandelingen niet de levensvatbaarheid of de bevestiging van gekweekte cellen beïnvloeden of toxische effecten op bacteriën.
Toekomstige ontwikkelingen:
NHOUD "> Omdat deze test wordt meestal uitgevoerd in multi-well celkweek platen, is het theoretisch mogelijk aan te passen aan een high-throughput screening operatie, die het onderzoek van de bibliotheken van de potentiële cel-functie-remmers, anti-infectieziekten of zou kunnen inhouden antibiotica ontworpen om intracellulaire bacteriën doel. Als alternatief kan een dergelijke benadering worden gebruikt om de mutant bibliotheken scherm om genen betrokken bij adhesie, invasie of intracellulaire overleving te identificeren. In sommige gevallen kan het wenselijk zijn om schuifkrachten (flow) in het model systeem op te nemen, bijvoorbeeld bij het modelleren van het endotheel, om nauwer na te bootsen van de in vivo omgeving. De huidige ontwikkelingen in het ontwerpen en produceren van flow cellen en microfluïdische celkweek systemen bieden de mogelijkheid van de tewerkstelling van de gentamicine protectie-analyse, in gastheer-pathogeen modellen die schuifkrachten op te nemen.Samengevat, is het protocol hier beschreven op basis van een soortgelijke aanpak toegepast gedurende vele jaren. Het is algemeen van toepassing op vele soorten gekweekte cellen en bacteriesoorten en kunnen grote hoeveelheden gegevens snel en tegen relatief weinig kosten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust (WT 0795880).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
