Summary
방법은 형광 이미징에 대해 서로 다른 척추 동물에서 하나의 생활 photoreceptor 세포의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 방법은 이미지와 같은 NADH이나 비타민 A와 같은 내생 fluorophores의 형광을 위해 사용하거나, CA에 민감한 exogenously 추가 형광 염료의 수
Abstract
척추 망막에서 phototransduction, 전기 신호에 빛의 변환,로드 앤드 원추 photoreceptor 세포 1-4에 의해 수행됩니다. 로드의 photoreceptors는 희미한 빛, 밝은 빛에서 원뿔의 비전에 대한 책임이 있습니다. Phototransduction는 photoreceptor 세포, 영상 안료, 기본 조명 감지기의 높은 농도를 포함하는 전문 구역의 바깥 부분에서 이루어진다. 망막 CIS, 단백질, 옵신에 첨부된 - 시각 색소는 발색단, 11로 구성되어 있습니다. 시각 색소에 흡수 광자는 11 발색단을 isomerizes - CIS를 모든 트랜스 있습니다. 이 photoisomerization는 막 잠재력에 변화 culminating, 그리고 전기 신호에 빛의 자극의 전달에 대한 데리고 반응의 폭포를 시작 시각 색소의 conformational 변화를 제공합니다. 빛의 자극에서 세포의 복구 빛으로 활성 중간체의 비활성화 및 멤브레인 잠재력의 회복을 포함한다. CA 2 +는 phototransduction에 관련된 효소의 몇 가지의 활동을 modulates, 그 농도가 빛의 자극에 따라 줄어 듭니다. 이러한 방법으로, CA 2 + 배경 빛으로 자극하고 적응에서 세포의 회복에 중요한 역할을합니다.
모든 트랜스 5-7로 CIS 발색단 - 복구 프로세스의 또 다른 필수적인 부분은 11 photoisomerization로 빛을 감지하는 동안 파괴되고있는 시각 색소의 재생이다. 이 중생은 APO - 단백질 옵신 뒤에두고, photoactivated 안료의 모든 트랜스 망막의 릴리스와 함께 시작됩니다. 출시된 모든 트랜스 망막이 빠르게 모든 트랜스 레티놀과 옵신에 NADPH를 이용한 반응 감소 것은 신선한 11 결합 - CIS 망막은 시각 색소를 개혁하기 위해 외부 세그먼트에 왔어요. 모든 트랜스 레티놀은 다음 전문 캐리어 Interphotoreceptor의 Retinoid 바인딩 단백질 (IRBP)에 의해 외부 세그먼트와 인접 세포 밖으로 전송됩니다.
단일 photoreceptor 세포의 형광 이미지들은 생리 및 세포 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. CA 2 +에 민감한 형광 염료 8-12뿐만 아니라 내부 세그먼트 칼슘 2의 역할 칼슘 2 + 점포 조명에 자세히 외부 세그먼트 칼슘 2 + 변화와 응답 사이의 상호 작용을 검사하는 데 사용할 수있는 + 항상성 13,14 . 형광 염료는 MG 2 측정에 사용할 수 있습니다 + 농도 15, 산도, 그리고 수성 및 멤브레인 구획 16 추적기로. 마지막으로, 모든 트랜스 레티놀 (비타민 A)의 본질적인 형광은 단일 photoreceptor 세포 17-19 년에 형성 및 제거의 속도론을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. Sylgard 덮인 요리, 실험 챔버 및 면도날의 준비
- Sylgard의 엘라스토머 코팅 35mm 팰컨 배양 접시가 하나의 photoreceptor 세포를 얻기 위해 외딴 망막의 적절한 자르고 필요합니다. 탄성체는 공급 업체의 지침과 소량이 계층과의 엉덩이를 커버하기 위해 각각의 그릇에 부어에 따라 준비가되어 있습니다. 요리는 코팅 후 커버 교체하고 그들을 저장합니다. 몇 일 시간에 탄성이 견고하고 요리를 준비하고 있습니다.
- 그들이 이미징 실험 과정 동안 고정되도록 절연 photoreceptors은 실험 챔버의 바닥에 붙어해야합니다. 이것은 폴리 - L - 라이신 또는 폴리 - L - ornithine로 코팅하여 실의 바닥을 달성입니다. 챔버 당 하나의 하나의 0.01 % 용액 200 μL를 추가하고, 먼지에서 보호하기 위해 종이 타월로 챔버 스를 커버. 솔루션은 건조 후, 닫힌 상자에 증류수 및 저장과 실 씻으십시오. 이주 이내에 사용하십시오.
- 실험의 끝에 회의소를 청소하려면, 석유 침지 렌즈와 세포 부스러기로부터 기름을 제거하기 위해 100 % 에탄올과 그들을 씻으십시오. 세포 파편을 제거하려면, 면화 - 스쳐 applicators을 사용하여 조심스럽게 챔버의 바닥을 씻어. 후, 증류수로 세척하고 다시 코팅하기 전에 챔버 스가 건조하게.
- 금속 커터와 함께 작은 조각 (8 일 블레이드에서)에 양날 면도날 컷.
2. 솔루션의 준비
- 솔루션의 구성은 종류에 따라 다릅니다. 양서류 들어, 링어가 (mmol / L)을 가지고 : 110 NaCl, 2.5 KCl, 1.6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, 산도 = 7.55 있습니다. 산도는 NaOH와 최종 값을 조정해야합니다. 포유류의 경우 링어가 (mmol / L)을 가지고 : 130 NaCl, 5 KCl, 0.5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium - HEPES, 산도 = 7.40 있습니다. 링어의 솔루션은 몇 달 동안 실온에서 잘 밀봉 보관하실 수 있습니다.
- 박테리아 성장을 피하기 위해 -20 ° C에서 보관 주식 포도당 용액, 1 몰 / L,.
- 실험 당일, 5 mmol / L.의 최종 농도 링어의 솔루션으로 포도당을 추가 하루의 끝에서, 링어의 그것이 박테리아를 성장 있기 때문에 포도당이 포함된 폐기하십시오.
3. 망막의 분리
- 망막의 적절한 절단을 위해 그것은 동물이 희생되기 전에 최소한 2-3시간에 대한 어두운 적응하는 것이 중요합니다. 동물은 어두운 방에 적당한 통풍이 컨테이너에 어두운 적응해야합니다.
- 절반 링어의 솔루션을 가진 두 개의 35mm 페트리 요리를 입력합니다.
- 희미한 붉은 불빛 아래에있는 동물을 희생하고 눈을 제거합니다. 그 후, 모든 절차는 해부 현미경 또는 비디오 모니터와 카메라를 사용하여 적외선에 따라 수행됩니다.
- 눈 바깥 표면으로부터 남은 조직을 제거합니다. 잘라 앞쪽에 부분을 제거한 후, 링어의 가득 배양 접시 중 하나에 세안 컵을 전송하기만하면됩니다.
- 유리체를 제거하고 신중하게 떨어져 곤란이나 첨부 파일을 절단하여 세안 컵의 나머지 부분에서 망막을 분리. 부드럽게 망막을 채취해서 세안 컵에서 완전히 분리.
- 플라스틱 전송 피펫 두 번째 페트리 접시에 망막을 전송합니다. 빛을 꽉 상자에서 망막을 포함하고있는 음식 보관하십시오.
4. 단일 photoreceptor 세포의 분리
- 모든 절차는 적외선에 따라 수행됩니다. 망막의 작은 조각을 잘라 Sylgard 덮인 요리에 플라스틱 피펫으로 전송합니다. 망막의 조각을 포함하고있는 솔루션의 볼륨은 250 μL에 대해해야합니다.
- 블레이드 홀더와 면도날의 작은 부분을 잡고 - 블레이드의 가장자리는 홀더에 약 45 °의 각도로해야합니다. Sylgard 계층에 대한 망막의 조각을 평평하게하고 Sylgard 계층에 붙어 유지하면서 날개가 잘게 망막의 조각을 잘라 사용합니다.
- 실험 챔버에 세포를 포함하는 솔루션을 200 μL를 전송 - Sylgard 덮인 접시에 망막의 나머지 조각을 두십시오. 빛을 꽉 상자에서 분리된 세포와 챔버 보관하십시오.
- 링어의로부터 2-3 ML를 추가 후, 해결하기 위해 세포를 10 분 기다립니다. 이 단계에서 분리된 세포는 염색 로딩 프로토콜에 따라 특정 형광 염료 (예 : Fura - 2)로 로드할 수 있습니다.
- 세포는 현재 실험에 대한 현미경 스테이지로 이동하실 수 있습니다.
5. 형광 이미징
- epifluorescence 현미경의 무대에 챔버를 전송합니다. 조정 솔루션 재관류, 온도 프로브, 적외선 조명 등
- 커튼을 닫고 실험을 시작합니다. 현미경 케이지 내부의 적외선 켜고, 실험 챔버의 하단에 초점을, 그리고 세포를 찾기 위해 무대를 이동합니다.
6. 대표 결과S :
그림. 1 도롱뇽 (Ambystoma tigrinum) 망막에서이 프로토콜을 취득한 건강한 고립로드 앤드 콘 photoreceptors의 형태를 보여줍니다. 샐러맨더 세포 때문에 그들의 큰 크기와 망막의 분리 후 몇 시간 동안 생존 능력의 단일 세포 형광 이미징 연구에 대한 광범위하게 사용되었습니다. 또한, 샐러맨더 망막에서 하나는 정기적으로 막대와 원뿔 photoreceptors 모두를 얻을 수 있습니다.
세포의 건강에 중요한 기준이 손상 타원체 (그림 1), mitochondria가 집중하고있는 세포의 일부의 존재입니다. 세포 DAPI 광학에 따라 볼 때, mitochondria의 농도는 NADH의 존재로 인해 강한 형광 신호 (그림 2) 제공합니다. 손상 타원체의 부족 실험. 그림 일반적으로 부적당 손상된 세포의 기호입니다. 3 부어 세포 기관과 응축 핵으로 손상된 샐러맨더로드 photoreceptor를 보여줍니다. 이러한 세포는 DAPI 광학에 따라 훨씬 낮은 형광 디스플레이지만, 타원체 영역 (산화 플라빈의 세포핵과 flavoproteins에서 발생)에 강력한 유행 신호를 보여 FITC 광학 아래의 조회. 격리된 photoreceptors의 건강을위한 또 다른 기준은 빛의 자극에 의해 즉시 자신의 외부 세그먼트에있는 모든 트랜스 레티놀을 (비타민 A) 생성하는 능력이 있습니다. 비타민 A의 생성은 그대로 대사 기계에 의존 NADPH의 상당한 양의 필요합니다. 그림 4와 5는 비타민 그대로 개구리와 마우스 막대의 photoreceptors 각각의 바깥쪽 세그먼트의 형성을 보여줍니다.
그림 1. 건강한 하나의 막대와 원뿔 photoreceptors. 세포는 호랑이 샐러맨더 망막으로부터 격리되었다. Phototransduction은 외부 세그먼트에서 일어나는와 타원체는 밀도가 mitochondria들이 즐비합니다. 로즈는 희미한 빛 비전, 밝은 빛이 비전에 대한 콘 책임이 있습니다.
그림 2. 샐러맨더로드 및 원뿔형 생활의 형광. 이들은 각각 ellipsoids에 강한 NADH의 형광없이 중요한 비타민들은 바깥 세그먼트에서 형광을 보여주는, 어두운 조정 세포 수 있습니다. 형광 이미지의 촬영은 어두운 - 적응 기간 후 가시 광선에 처음으로 노출을 나타냅니다.
그림 3. 손상된 샐러맨더로드 photoreceptor. 부어 세포 본체와 응축 핵이 손상을 나타내는 있습니다. 세포는 산화와 최소한의 NADH 신호 (DAPI 광학 장치)가있다지만, 훨씬 강력한 유행 신호 (FITC 광학)입니다.
그림 4. NADH와 레티놀과 함께 개구리 막대. 이것은 타원체 지역에서 강력한 NADH의 형광을 보여주는 건강한 개구리 막대의 photoreceptor입니다. 빛의 노출 전에 바깥 부문 최소한의 형광이 있습니다. 빛의 노출에 따라, 때문에 비타민 A의 형성에 외부 세그먼트 형광의 상당한 증가가
그림 5. 레티놀과 마우스 막대. 이것은 마우스 막대의 photoreceptors의 타원체 영역 강한 형광 신호를 표시하지 비타민 A의 형성에 의한 빛의 노출 후 상당한 외부 세그먼트 형광을 보여주는 건강한 마우스 막대의 photoreceptor입니다.
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Discussion
건강 분리된 세포가 얻은 정보가 아닌 경우, 문제는 망막의 분리 또는 건강 또는 그 돼지와도 자리잡고 있습니다. 일반적으로, 눈 및 유리체의 전면을 제거 후, 망막이 쉽게 안료 상피를 리프트. 그렇지 않으면, 세안 컵의 주변부터 해제로 껍질보십시오. 아직 분리하기 어려운 경우에는 가능성이 가능성이 동물은 시간의 적절한 기간 동안 어두운 적응되지 않았음을, 또는 빨간 불빛이 너무 밝은 있습니다. 동물에 대한 적절한 어두운 적응하고, 희미한 붉은 불빛을 보장합니다. 망막에있는 막대의 photoreceptors의 존재는 고립 망막의 색상을 선택하여 쉽게 ascertained 수 있습니다 망막의 작은 조각을 잘라 다음 방 불빛 아래에서 볼 수있는 별도의 페트리 접시에 그것을 전송할 수 있습니다. 망막 포함 막대의 photoreceptors의 조각 신속하게 밝은 붉은 색 (rhodopsin로 인해)은 페이드 있습니다. 무색 조각이 rhodopsin의 부재를 나타내는하고, 따라서 막대의 photoreceptors의 것입니다. 이 중 안료 상피에서 망막의 부적 절한 분리하거나 건강하지 못한 망막에 의한 것입니다. 이러한 경우에는 동물과 적절한 어둠 적응의 건강을 보장해야합니다. 건강한 망막을 취득하지만, 경우 건강하지 고립된 세포가 다음 문제는 베고이 가장 가능성이 높습니다. 멋진 돼지가 중요 : 돼지가 너무 거칠어 경우, 또는 망막이 떨어진되고, 그것은 고립된 세포의 대신에 망막의 조각에서 주로 발생합니다. 좋은 자르고는 일반적으로 솔루션에 나타나는 세포의 "구름"을 초래합니다.
단일 photoreceptors 세포의 형광 이미지는 실시간으로 생리적 프로세스의 광범위한 탐사로, 이러한 NADH, 유행이나 비타민 A와 같은 내생 세포 fluorophores뿐만 아니라 다른 요인에 민감한 형광 염료를 사용할 수 있습니다. 방법은 같은 도롱뇽 (Ambystoma tigrinum) 17,18와 개구리 (라나 pipiens) 20 양서류, 도마뱀 (게코 게코) 21, 생선 (zebrafish, Danio rerio) 11, 및 마우스 (뮤스를 포함한 다양한 수종에 적용할 수 musculus) 22. 마우스 세포로 메서드의 확장은 유전자 조작 동물의 다른 종류의 연구를 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
네이 부여 EY014850 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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