Summary
הגבלת תא דילול מבחני השתלת משמשות כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת דג הזברה syngeneic כי לפתח לוקמיה fluorescently שכותרתו ופרטים כיצד לבודד השתלת תאים אלה לוקמיה על הגבלת דילול לתוך חלל הצפק של דג הזברה מבוגר.
Abstract
עצמית חידוש תאים סרטניים הם תאים מסוגים רק בתוך הגידול, כי יש יכולת בלתי מוגבלת כדי לקדם את צמיחת הגידול, ידועים כמו כן הגידול מתפשט תאים או תאים סרטניים, ליזום. הוא חשב כי המיקוד הללו עצמית חידוש תאים להרס תחסום התקדמות הגידול לעצור נסיגה, שיפור משמעותי פרוגנוזה החולה 1. הדרך הנפוצה ביותר כדי לקבוע את תדירות עצמית חידוש תאים בתוך הגידול הוא תא הגבלת דילול השתלת assay, שבו תאים סרטניים הם הושתלו בחיות הנמען במינונים הגדלת; חלקם של בעלי החיים לפתח גידולים משמש לחשב את מספר עצמית חידוש תאים בתוך מדגם הגידול המקורי 2, 3. באופן אידיאלי, מספר רב של בעלי חיים ישמשו בכל ניסוי דילול הגבלת לקבוע במדויק את השכיחות של גידולים להפצת תאים. עם זאת, ניסויים בקנה מידה גדול הכוללים עכברים הם יקרים, ורוב מבחני דילול להגביל את השימוש רק 10-15 עכברים בכל ניסוי.
דג הזברה זכו לגדולה כמודל סרטן, במידה רבה בשל הקלות שלהם מניפולציה גנטית והכלכלה שבה ניסויים בקנה מידה גדול יכול להתבצע. בנוסף, סוגי סרטן הדגם של דג הזברה נמצאו מקרוב לחקות את מקבילו האנושי שלהם 4 המחלה. אמנם זה אפשרי להשתיל תאים סרטניים מדגים אחד למשנהו על ידי הקרנה משנה קטלני של חיות הנמען, התחדשות של מערכת החיסון לאחר 21 ימים בדרך כלל גורם רגרסיה הגידול 5. היצירה האחרונה של דג הזברה syngeneic יש להקל מאוד מחקרים השתלת הגידול 6-8. בגלל החיות האלה זהים מבחינה גנטית, נקלטים התאים המושתלים לתוך הגידול וחסונה דגים הנמען הגידול יכול להיות פיקוח על פני תקופות זמן ארוכות. Syngeneic דג הזברה הם אידיאליים עבור הגבלת מבחני השתלת דילול ב כי תאים סרטניים לא צריך להתאים את הגידול microenvironment זרה, אשר עשוי לזלזל עצמית חידוש תדירות תא 9, 10. בנוסף, אחד של השתלות הושלמו בהצלחה באמצעות דג הזברה syngeneic 8 וכמה מאות בעלי חיים ניתן להשתיל בקלות ו כלכלית בעת ובעונה אחת, אשר שניהם משמשים כדי לספק הערכה מדויקת יותר של תדירות עצמית חידוש התאים.
הנה, שיטת מוצג ליצירת העיקרי, fluorescently שכותרתו תא T לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL) ב דג הזברה syngeneic, ואת השתלת גידולים אלה על הגבלת דילול לתוך דגים בוגרים כדי לקבוע תדירות עצמית חידוש התאים. בעוד לוקמיה מסופק כדוגמה, פרוטוקול זה מתאים כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים סרטניים באמצעות כל מודל של דג הזברה.
Protocol
1. DNA עוברי דג הזברה microinjection
- Linearize rag2: cMyc ו rag2: 11-GFP בונה DNA על ידי לעכל 10μg של כל פלסמיד עם NotI ב 37 ° C במשך הלילה.
- פנול: לחלץ כלורופורם המשקע פלסמידים, ו resuspend כל 20μL H 2 O.
- קבע את הריכוז של ה-DNA על ידי הפעלת דילול 01:01, 01:05 ו - 01:10 של כל פלסמיד מעוכל על 1% agarose ג'ל עם 20μL, 10μL ו 5μL סולם גבוה מגוון DNA. זה סוג של כימות הוא בדרך כלל יותר מדויק לקרוא ספקטרומטר.
- לדלל את ריכוז ה-DNA כדי הסופי של 60ng/μL ב 1M KCl 0.5 X TE עבור הזרקה לתוך זן CG1 (או זן syngeneic אחרים) עוברי דג הזברה באמצעות 30ng/μL rag2: cMyc + 30ng/μL rag2: ה-GFP.
- זריקות יש לבצע כמו 12 הפגינו בעבר, 13. בקצרה, דג הזברה הזכר והנקבה מוגדרים בתאי ההזדווגות בלילה לפני הזריקה. ביום של הזריקה, ה-DNA הוא נטען לתוך מחט הזריקה, הלחץ הוא מותאם כך בועה בקוטר 50μm מסולק (30pg DNA), אשר נמדד על ידי מיקרומטר הבמה. לאחר מכן, עוברים מוזרקים בשלב אחד בתא, עם ה-DNA להיות מוזרק ישירות לתוך התא, ולא בחלמון. הישרדות של CG1 עוברים מוזרק וזחלים ירודה בדרך כלל, ורק 5% דגים יהיה בהצלחה לשלב את transgene, ולכן> 600 עוברים צריך להיות מוזרק על מנת להבטיח כי דגים מסוימים יפתחו לוקמיה.
- חנות עוברים מוזרק על 28.5 ° C, ולהסיר את העוברים המתים לאחר 24 שעות. בעלי חיים מועברים לאחר מכן טנקים גדול 5 ימי חייך והעלה כפי שתואר לעיל 14.
2. הקרנת עבור T-ALL העיקרי הזחלים דג הזברה
- כ 28 ימים לאחר ההזרקה, להרדים דג הזברה הזחל ידי הוספת 200μL של 4ng / m Tricane-S כדי 25mL מים מערכת דגים בצלחת פטרי.
- בדוק את הזחלים לפיתוח fluorescently שכותרתו T-ALL באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence בהגדלה 20X, באמצעות גל עירור ופליטה 485/20 530/25 מסנן הקרינה לזהות GFP (איור 1).
- הפרד הזחלים חיובי הגידול מאלה שלילית. הזחלים שלילי ניתן לבדוק בנקודת זמן מה לאחר מכן, פעם גידולים עשויים גדלה עוד יותר, כדי לוודא ששום T-ALL דגים חיובי הוחמצו.
- צג T-ALL דגים חיובי לפחות פעם בשבוע באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence כדי לעקוב אחר הגידול.
3. בידוד וטיהור של fluorescently שכותרתו תאים לוקמיה העיקרי
- כאשר ה-GFP חיובי תאים לוקמיה יש עקפה> 50% של החיה, להקריב את הדג על ידי הוספת 1mL של 4ng/mL Tricane-S בצלחת פטרי המכילות 9mL מערכת מים ודגים.
- מניחים את הדג בצלחת פטרי חדשה המכילה 1mL 0.9X PBS עם סרום 5% שור עוברית למאגר תאים. מרוכך את הדג עם pipet להב, תער תערובת לנתק גושי תאים גדולים, ולאחר מכן להעביר את התאים דרך מסננת רשת 40μm לשפופרת 50 מ"ל. אין צורך לנתק את כל גושי רקמה לתוך תאים בודדים.
- Pipet 500μL התאים לצינור קלקר 4mL. הוסף יודיד 1μL 1mg/mL propidium (PI), אשר תווית תאים מתים. וורטקס, אז לשמור על התאים על הקרח.
- הקורבן wild-type CG1 דגים, מרוכך ומתח באותה צורה כמו לעיל כדי לאסוף תאים נורמליים, המשמשים כנשא של תאים סרטניים במהלך transplant.Add 4mL 5% FBS ב 0.9X PBS על צינור 50 מ"ל על סך נפח של 5 מ"ל.
- ספירת תאים נורמליים, כדי לדלל 3x10 5 תאים / מ"ל ב -5% ב FBS 0.9X PBS, אז 100μL/well pipet צלחת 96-היטב.
- באמצעות סדרן פלואורסצנטי תא פעיל (FACS), GFP סוג חיובי, שלילי לצרכן גידול התאים (איור 2 א ', ב') לתוך צלחת 96-היטב המכילה כדוריות דם במינון הבא: 10 תאים / גם לתוך 48 בארות, 100 תאים / טוב תוך 24 בארות, 1000 תאים / גם לתוך 12 בארות, ו -10,000 תאים / 6 גם לתוך בארות. בנוסף, 10,000 תאים יש למיין לתוך באר ללא כדוריות דם נורמלי, reanalyzed באמצעות FACS להעריך את טוהר הכדאיות של תאים ממוינים (איור 2C).
4. הגבלת השתלת דילול לתוך דג הזברה מבוגר
- גלולה התאים על ידי centrifuging את הצלחת 96-2000xg היטב במשך 10 דקות.
- הסר 95μL של supernatant ו resuspend התאים 5μL הנותר.
- החזק מבוגר (> 60 ימים) syngeneic בצד הגחון דג הזברה למעלה, להזריק את ההשעיה התא לתוך חלל הצפק, באמצעות 26G / 2 "מיקרו מזרק. דג הזברה לא צריך להיות מורדם לפני ההשתלה. בדרך כלל, 45 דגים מושתלים עם 10 תאים לוקמיה, 20 מושתלים עם 100 תאים, 7 מושתלים עם 1,000 תאים 5 דגים מושתלים עם 10,000 T-ALL תאים.
5. ניתוח על מנת לקבוע לוקמיה, ייזום תדירות תא
- כ 28 ימים לאחר ההשתלה, המושתל לבחון את הדג עם מיקרוסקופ epifluoresence באמצעות גל עירור ופליטה 485/20 530/25 לסנן לזהות GFP פלואורסצנטי. רשום את מספר הדגים חיובי לכל המספר הכולל של דגים מוזרק.
- לבחון מחדש את הדג כל 14 ימים עד 90 יום ולהקליט את מספר הדגים חיובית. כאשר דג גידול חיובי להיות גוסס, הקרבת בעלי חיים על ידי Tricane-S ממנת יתר.
- קלט את התוצאות לתוך טבלה, כפי שמוצג באיור 3D. העלה את הנתונים לתוך מבוססי אינטרנט Elda (דילול אקסטרים הגבלת ניתוח) תוכנה סטטיסטית ב http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html 15, אשר עושה שימוש בתדר של בעלי חיים חיוביים ושליליים הגידול ב כל מנה השתלת כדי לקבוע את תדירות עצמית חידוש תאים לוקמיה בתוך הראשוני T-ALL.
6. נציג תוצאות:
Microinjection DNA לעוברי דגים syngeneic לעתים קרובות תוצאות שיעור הישרדות נמוך של העוברים מוזרק, עם <60% עוברים ששרדו למשך 24 שעות. בנוסף, ההישרדות של הדג syngeneic מוזרק בדרך כלל עניים במהלך התפתחות הזחל, לעתים קרובות עם <20% לשרוד במשך 28 ימים. לכן חשוב להזריק מספר גדול של עוברים כדי ליצור דג מהונדס כי יפתחו T-ALL.
כדוגמה, CG1 עוברים זן הוזרקו rag2: cMyc + rag2: ה-GFP. Transgenes שיתוף לבודד בעובר המתפתח, כך שכל תא מבטא GFP גם להביע cMyc. הזחלים הוקרנו על יסודי T-ALL לאחר 28 ימים (איור 1). עבודות קודמות הראו כי כ 5% דגים מוזרק יהיה חיובי GFP-T-תאים בתוך התימוס שלהם (איור 1), ו - 100% של דגים אלה יפתחו לוקמיה כמו ה-T לתאים להפוך 11 טרנספורמציה. בעוד חלק קטן של דג הזברה עשויה להיות לוקמיה מתקדמת יותר, כי קל מאוד לזהות בכל יום 28, רוב רק יש GFP חיובי התימוס (איור 1), ולכן הזחלים יש לבחון בנפרד בהגדלה גבוהה על מנת להבטיח כי כל חיובי דגים נבחרים. GFP-T-חיובי כל התאים יהיה לעקוף> 50% של החיה בין 45-70 ימים.
בדוגמה בתנאי, דג הזברה הוקרבו על 65 ימים של חיים, ותאי לוקמיה היו מבודדים FACS מיון להגבלת השתלת דילול. תאים בודדים היו יודיד propidium שלילי GFP חיוביים (איור 2) מוינו לתוך צלחת 96-היטב. Reanalysis נעשה על 10,000 תאים ממוינים על מנת להעריך את הכדאיות (רצוי> 95%) טוהר (רצוי> 92%, איור 2). המושתלים T-במחזה 'כטוב בעיניכם בדרך כלל להתעורר לפני 28 ימים, אבל גידולים מסוימים עלול לקחת יותר מ -60 ימים כדי להתפתח. בדוגמה זו, ביום 28, גידולים בשלב מוקדם נראו בשטח של ה-GFP חיובי תאים ליד הזריקה (איור 3B), בעוד כמה T-במחזה 'כטוב בעיניכם היו התקדם יותר, לאחר התרחבה כדי למלא את חלל הצפק (איור 3 ג) . מנתוני הגבלת תא דילול משלושה מבחני השתלת העיקרי שונה T-במחזה 'כטוב בעיניכם מוצגים באיור 3D. בניסויים אלה, מעל 220 בעלי חיים הושתלו, אשר ניתן להשיג בקלות על ידי אדם אחד תוך כמה שעות. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה Elda הראו כי, בממוצע, 1 ב 135 T-ALL התאים היו עצמית חידוש לוקמיה, הפצת התאים (איור 3E).
איור 1 הזחלים דג הזברה מוזרק בשלב אחד לתא עם סמרטוט:.:-CMyc + סמרטוט::-eGFP הוקרנו לצמיחה לוקמיה העיקרית 28 ימים לאחר ההזרקה. דגים (*) היה ה-GFP-T-חיובי תאים בתוך התימוס; הדג הזה יפתחו T-ALL כמו ה-T לתאים להפוך הפך במשך הזמן. בשלב זה נפוץ מאוד בכל יום 28. אחת דגים (**) היה מתקדם T-ALL אשר התפשט לרקמות הרכות. הדגים הנותרים השניים שלילי הגידול. התמונה צולמה בהגדלה של 16X.
איור 2. Fluorescently שכותרתו T-ALL תאים מוינו מבעלי חיים חולים בשימוש assay הגבלת תא דילול השתלה. ראשית, שער נמשך לבחור תאים בודדים (פאנל השמאלית העליונה), ואז התאים יודיד propidium שלילי נבחרים (הפאנל השמאלי באמצע). לבסוף, שער נמשך לבחור רק את ה-GFP חיובי תאים לוקמיה למיון (הפאנל השמאלי התחתון). תאים מסודר צריך להיות reanalyzed להעריך כדאיות וטוהר לפני ההשתלה (לוחות מימין).
איור 3. דג הזברה נבדקו לצמיחה לוקמיה 28 ימים לאחר ההשתלה. דגים הם נג הגידול אוAtive (א), יש גידולים קטנים גדל במקום ההזרקה (ב), או יש לוקמיה התקדמה (C). התמונות צולמו בהגדלה 7x. המספר הכולל של דגים לוקמיה חיובי לכל המספר הכולל של דגים המושתלים בדילול כל נרשם, כמו (D). הנתונים הם קלט לתוכנית Elda מבוססי אינטרנט כדי לחשב את מספר עצמית חידוש התאים לוקמיה העליונה והתחתונה 95% מרווחי (E).
Discussion
הכוח העיקרי של השימוש דג הזברה בחקר הסרטן היא כי מספר רב של בעלי חיים יכול לשמש בעלות נמוכה יחסית. זה חשוב במיוחד בהגבלת תא דילול השתלת מבחני, שם את הפרופורציות של חיות המושתלים כי לפתח גידולים למספר הכולל המושתלים משמשות כדי לקבוע תדירות הגידול ייזום התא. בשיטה המוצגת כאן, מעל 70 מקבל חיות השתלת משמשים לכל assay, מתן אומדן מדויק של מספר גידולים הפצת התא. גם את מספר בעלי החיים המשמשים ואת מנות של התאים הסרטניים המושתלים צריך להיות מותאם מודל סרטן נתון, למשל, אם הניסויים הראשוניים להראות גידולים ייזום תאים הם נדירים, במינונים ההשתלה עשוי להיות שימושי 100,000, 50,000, 10,000 ו -1,000 תאים לכל ההשתלה.
Syngeneic זני דג הזברה שימושיים הגבלת ניתוח דילול. עם זאת, זנים אלה עדיין אינם בשימוש נפוץ במעבדות הכל, כמה דגמים סרטן דג הזברה קיימים רק דגים allogenic. הגבלת תא השתלות דילול ניתן לבצע wild-type זנים שעברו אבלציה החיסון, למרות התדירות העצמית חידוש התא עשוי להיות מחושב 1-10 לקפל גבוה יותר מאשר אם syngeneic דג הזברה שימשו 8. חשוב לציין כי מינון גבוה של תאים אמור לשמש להשתלה לתוך הלא החיסונית, מקבלי מתאימים מוקרן, כמו כמה תאים סרטניים לא ישרדו את ההשתלה microenvironment זרה. בנוסף, גידולים רבים יתחילו לסגת לאחר 21 ימים כאשר מערכת החיסון החי של הנמען מתאוששת, כך חיות יש לבחון את הגידול כל 7 ימים לאחר ההשתלה.
השיטות שהוצגו כאן מתאימים לשימוש עם כל מודל סרטן דג הזברה, ויש להם עד כה נעשה שימוש כדי לקבוע גידולים ייזום תדירות תא T-cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה הן 8, ומודל גידולים מוצקים, רבדומיוסרקומה 16. גידולים אלה היו שכותרתו fluorescently ידי הזרקה משותף של עוברים עם oncogene והן סמן פלואורסצנטי, כי ה-DNA שיתוף שמפריד בין, כל תא לבטא את oncogene גם לבטא את חלבון פלואורסצנטי 17. בעוד פלואורסצנציה מומלץ משום שהוא מאפשר מעקב אחר הגידול ללא צורך להקריב את החיה מספק דרך ישר קדימה לבודד תאים סרטניים על ידי FACS, אפשר לתייג תאים סרטניים עם נוגדנים גידולים ספציפיים כדי להקל על מקבלי טיהור שלהם אף מכתים הנוגדן דג הזברה עשויים לדרוש אופטימיזציה.
לבסוף, פעם אחת את השכיחות של גידולים להפצת תאים נקבע לסוג גידול נתון, אפשר להשתמש אלה מבחני לזהות את המנגנונים ששולטים תדירות הנייד שלהם. לדוגמה, תאים סרטניים העיקרי יכולים להיות מטופלים עם מעכבי מסלול ספציפי לפני השתלת הגבלת דילול, או דגים המושתלים עצמם עשויים להיות במינון עם סמים. בנוסף, גנטיקה של גידולים עצמם ניתן לטפל על ידי הזרקת הדגים חד תא הבמה עם בגן של עניין, כך גידולים ראשוניים וכתוצאה מכך יהיה מעל לבטא את הגן. בניסויים אלו, כל השפעה על תדירות עצמית חידוש התא יהיה שנצפתה מבחני דילול מגבילים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המימון סופק על ידי NIH מענקים 5T32CA09216-26 (עבור JSB), ו K01 AR055619-01A1 ו 3 K01 AR055619-03S1 (עבור DML), כמו גם על ידי אלכס לימונדה סטנד Foundation, גזע הרווארד Cell מכון האמריקנית לסרטן האגודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 | |
| Phenol:Chloroform | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 | |
| Syngeneic zebrafish | References6-8 | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-036 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" Microsyringe | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Zhou, B. -B. S. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).
- Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice. Stem Cells. 15, 199-207 (1997).
- Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption. J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Taylor, A. M., Zon, L. I. Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation. Zebrafish. 6, 339-346 (2009).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).
- Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish. Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).
- Smith, A. C. H. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells. Science. 317, 337-337 (2007).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm. Science. 324, 1670-1673 (2009).
- Langenau, D. M. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. , (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).
- Ignatius, M. S. In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth. , Forthcoming (2010).
- Langenau, D. M. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).
