electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
OHCs는 Corti, 포유류의 내이 (内耳) 안에있는 청각 기관의 오르간에 위치하고 원통형 sensorimotor 세포입니다. 이름은 "세포는"stereocilia, 소리 에너지를 1 감지 및 전달을위한 중요한 요소들의 특징 혀끝의 번들에서 유래. OHCs 변경할 수있는 형태를 연장하다 단축하고, 벤드 -에, 전기 기계 및 화학 자극에 응답하여, 모터의 응답이 음향 신호의 증폭 달팽이 2 중요 간주됩니다.
I) electromotility, 일명 빠른 운동성, 밀도 OHC 플라즈마 막의 포장 모터 단백질의 전기 구동 conformational 변화에서 파생 마이크로초 범위의 길이 변경, II) 느린 운동성,의 모양 변경 : OHC의 자극은 두 가지 운동성이있는 답변을 유도 초 밀리초는 cytoskeletal 개편 2, 3을 포함하는 범위입니다. OHC 벤딩은 측면 플라즈마 막, 또는 그 모터 단백질 (예를 들어, 세포의 긴 축에 전기 현장 직각 포함) 4 비대칭 전기 자극에서 모터 단백질의 비대칭 분포에서 중 electromotility과 관련된, 그리고 결과입니다. 기계 및 화학적 자극은 세포 및 / 또는 그들의 환경의 이온 조건의 변화 또한 플라즈마 막 - 임베디드 모터 단백질 5, 6을 자극 수 있지만, 본질적으로 느린 운동성이있는 응답을 유도. OHC 운동성이있는 응답 달팽이 앰프의 필수 요소, 음향 주파수 (대략 인간 20 Hz로 20 kHz에서에서)에서 이러한 운동성이있는 반응의 정성 및 정량 분석되기 때문에 연구 7 청각 분야에서 매우 중요한 문제입니다.
고속 videocameras, LED 기반의 조명 시스템, 정교한 이미지 분석 소프트웨어를 결합하여 새로운 이미징 기술의 개발은 이제 외부 교류 전기장 (EAEF)에 안정적인 질적 및 절연 OHCs의 운동성이있는 응답의 양적 연구를 수행할 수있는 기능을 제공합니다 8. 이것은 이전의 접근 9-11의 한계의 대부분을 circumvents 간단하고 비침습 기술입니다. 또한, LED 기반의 조명 시스템은 샘플에 사소한 열 효과를 극도의 밝기를 제공하며, 때문에 비디오 현미경의 사용, 광학 해상도는 기존의 가벼운 현미경 기술 12보다 적어도 10 배 이상이다. 예를 들어, 실험 설치가 여기서 설명과 함께 약 20 NM의 세포 길이의 변화는 일상적으로하고 안정적으로 10 kHz에서의 주파수에서 감지하고,이 해결 방법은 더 낮은 주파수에서 향상시킬 수 있습니다.
우리는이 실험 접근 OHC의 운동성를 기본 세포와 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이됩니다 확신하고 있습니다.
프로토콜
1. OHCs의 분리
- 기니 돼지, 마우스 또는 포유류의 동물 모델에서 관자놀이 뼈를 수확하여이 절차를 시작합니다.
- 다음, 달팽이관을 폭로하기 위해 탐문 니퍼를 사용하여 관자놀이 뼈를 열고 Leibovitz L - 15에 젖어. 뼈다귀 쉘 그대로 유지, 신중하게 뼈 초과를 제거합니다. 이 모든 포유 동물 종의 시간적 뼈를에 적용되는 일반적인 절차입니다 반면에 아주 작은 동물로부터 현세의 뼈를을 상대할 때는 기술에 사소한 변화가 필요할 수 있습니다. 오래된 동물 불라는 일반적으로 프로 시저에 추가 합병증을 소개하고, calcified입니다.
- 마이크로 관찰에서 달팽이관의 꼭대기의 영역을 열고 선의 vascularis 및 # 11 메스 블레이드의 끝부분을 사용하여 나선형 인대를 제거 마이크로 지점 선택하고 고급 트위터.
- 트위터를 사용하여 달팽이 modiolus에서 Corti의 오르간을 벗어, 5 분 실온에서 L - 15 1mg/ml collagenase에 넣어.
- 달팽이관의 기저 전환에서 OHCs이 필요한 경우, 선택과 달팽이관의 기반을 덮고있는 뼈다귀 껍질을 제거하고, Corti의 오르간을 제거하기 전에 메스 블레이드를 사용하여 측두 골의 소용돌이를 구분한다.
- 50 μL 해밀턴 주사기를 사....
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토론
여기에 제시 실험 방법은 세포의 움직임에 어떤 제한없이 kHz에서 범위에서 OHC 운동성이있는 응답을 추정 수 있습니다. 다른 자극 프로토콜, 추가적인 마커 (microspheres)은 전기장에 대하여 세포의 방향에 잘 변화로, 그것이 가능한 이전에 액세스할 세부 수준 OHC의 운동성의 새로운 측면을 조사합니다. 다른 방법은, 예를 들어 photodiodes 9 레이저 도플러 vibrometry 10을 사용 이들은 세포의 위치를 꽉 컨트롤을 필요로합니다. 여기, 반대로 모든 측정은 동일한 세포에 속한 지점 사이에 수행하고 있으며, 모든 배기량은 세포 모양이 아닌 참조의 외부 프레임과 관련하여 자신의 운동과 변화에 연결되어 있습니다. 횡단면 OHC 지역의 안정적인 측정도 쉽게 OHC 볼륨의 빠른 변화의 추정을 허용하는, 얻을 수 있습니다. 또한,보다 빠르고 민감한 카메라와 더 나은 이미지 분석 소프트웨어의 지속적인 개발이 메서드의 품질의 지속적인 향상을 보장합니다. 기술, 플라즈마 막 전체.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
건강 그란츠 R01DC10146/R01DC010397 국립 연구소에 의해 지원 작품, P30 DC006276 연구 코어를 NIDCD하고, 헤리. 그 내용은 저자의 단독 책임이며 반드시 NIH 또는 헤리의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 관심에 대한 기존 또는 잠재 갈등을 선언하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| Leibovitz의 L - 15 | Gibco | 21,083 | |
| Collagenase (타입 4) | 시그마 - 알드리치 | C5138 | L - 15 1mg/mL |
참고문헌
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B.
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재인쇄 및 허가
