Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Summary

Een methode wordt beschreven voor de bereiding van een 3-dimensionale matrix van collageen type I en primaire humane fibroblasten. Deze organotypische gel dient als nuttige substraat invasieve celmigratie beoordelen omdat het bootst basiskenmerken van weefsel stroma en vatbaar is voor vele vormen van microscopie.

Abstract

Celmigratie fundamenteel is voor vele aspecten van de biologie, zoals ontwikkeling, wondgenezing, de cellulaire responsen van het immuunsysteem, en metastase van tumorcellen. Migratie onderzocht op dekglaasjes om cellulaire dynamica vatbaar voor onderzoek maken met lichtmicroscopie. Echter duidelijk geworden dat vele aspecten van celmigratie afhankelijk van de beschikbaarheid van de lokale omgeving zoals de elasticiteit, eiwitsamenstelling en poriëngrootteverdeling, niet nauwgezet worden vertegenwoordigd door stijve tweedimensionale substraten zoals glas en plastic ^1. Verder heeft interactie met andere celtypen, waaronder stromale fibroblasten ² en immuuncellen ^3, is aangetoond dat een cruciale rol spelen in de invasie van kankercellen. Onderzoek op moleculair niveau steeds meer aanwijzingen dat moleculaire dynamica, inclusief respons op geneesmiddelen behandeling van identieke cellen significant verschillend in vergelijking in vivo ^4.

Idealiter zou het best om celmigratie bestuderen in de natuurlijke context in levende organismen, maar dit is niet altijd mogelijk. Intermediate weefselkweeksystemen, zoals cel afgeleide matrix, matrigel, organotypische kweek (hier beschreven) weefselexplantaten, organoids en xenografts, zijn daarom belangrijk experimentele tussenproducten. Deze systemen bij benadering bepaalde aspecten van een in vivo omgeving, maar zijn meer ontvankelijk voor experimentele manipulatie zoals het gebruik van stabiel getransfecteerde cellijnen, medicamenteuze behandeling regimes, op lange termijn en hoge-resolutie beeldvorming. Deze tussenproducten zijn vooral bruikbaar als probes om testterreinen valideren en stellen parameters die voor beeld de dynamische respons van cellen en fluorescente reporters voor onderneming imaging in vivo ^5. Als zodanig kunnen zij een belangrijke rol dienen in minder noodzakelijk experimenten living dieren.

Protocol

1. Oprichting van fibroblast culturen van de huid explantaten

1. 4 mm stansbiopsieën verkregen uit menselijk onderarm worden in MEM aangevuld 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,25 ug / ml Fungizone.
2. Trim alle spek en fijn de biopsie in kleine stukjes snijden door tuimelen een aantal 24 scalpelmes tegen de bodem van de petrischaal.
3. Plaats weefsel slurry in een ²⁵ cm2 weefselkweekfles met primaire fibroblast groei media (MEM aangevuld met 10% FCS, 100 units / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 25 ug / ml Fungizone) toegevoegd totdat het oppervlak van cuvet bedekt maar vloeibaar diepte onvoldoende is voor weefsel te zweven.
4. Na 3 dagen incubatie bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van _5% CO2, 3 ml primair fibroblast groei media.
5. Na nog eens 3 dagen incubatie veranderingsmedia met verse primaire fibroblast growth media of cells zijn bijna confluent zij 01:04 worden gesplitst in nieuwe media. (Fungizone kan worden weggelaten vanaf dit punt).

2. Fase I - Voorbereiding van collageen I van rat staart

Opmerking: Protocol voor ongeveer 12-14 adolescent (vers of bevroren) rat staarten

1. Bereid rattenstaart door wassen in 70% ethanol en verwijder pezen als volgt:
2. Verwijder het vel van rattenstaart door het snijden in het midden van de staart van boven naar beneden met een scalpel en pellen langs de lengte van de staart.
3. Maak pees uit de kern van het proximale gebied van de staart.
4. Verwijder pees naar het distale gebied van de staart vermijden mantel met getande forceps.
5. Extract 1 g van pees / 250 ml 0,5 M azijnzuur door roeren bij 4 ° C gedurende 48 uur.
6. Centrifugeer het extract (7.500 xg) gedurende 30 minuten en gooi de pellet.
7. Voeg een gelijk volume van 10% (w / v) NaCl aan de supernatant en roer gedurende 30-60 minuten.
8. Dialyseer de collageenoplossing tegen veranderingen van 6-8 6L ~ 17,5 mM azijnzuur (1 ml ijsazijn per liter koud water, change 2 x daags).
9. Centrifugeer gedialyseerd collageen bij 30.000 xg gedurende 1,5 uur.
10. Verwijder supernatant en plaats in steriele kolf.
11. Stel de collageen I ~ concentratie 2 mg / ml met 0,5 mM azijnzuur bij 4 ° C.

3. Fase II - Het opzetten van de 3D-matrix met ingebouwde fibroblasten (laten contracteren voor 8 dagen).

1. Monteer het mengsel met koud reagentia bij 4 ° C in een vooraf gekoelde fles. Houd collageen I op ijs.
2. Voor een T75 fles van confluente primaire fibroblasten (~ aantal cellen 1 x 10 ⁶⁾ gebruik:
   • 25 ml rattenstaart collageen (ca. conc 2mg/ml)
   • 3 ml 10xMEM
   • 0,22 M NaOH: ten eerste, voeg 2 ml, dan druppelsgewijs onder roeren, totdat het collageen wordt oranje,
   • maar niet roze (meestal maximaal 3 ml). Geschatte p ^H = 7,2.
   • Opmerking: Het is belangrijk dat de medium / gel blijft neutraal of enigszins zure fibroblasten niet samentrekken de gel bij blootstelling zelfs licht alkalische omstandigheden.
3. Trypsinise de fibroblasten, draaien op 400 xg gedurende 5 minuten en verwijder supernatant.
4. Gedurende 5 minuten laten draaien boven: Bereid 12 x 35 mm plastic schaaltjes - normaal 12 gerechten bereiken van een fles van fibroblasten / collageen mix.
5. Resuspendeer fibroblasten in 3 ml FCS en onmiddellijk toe te voegen aan het collageen mix en roer.
6. Plaat ongeveer 2,5 ml van collageen / fibroblast per schaal zo snel mogelijk. Proberen bellen en collageen omgeving voorkomen.
7. Laat de collageen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van _5% CO2 in lucht gedurende 10 minuten.
8. Voeg 1 ml fibroblast groeith media (DMEM + 10% FCS).
9. Maak de collageen / fibroblast matrix van de wanden van de capsule met een pipet.
10. Volgende dag: Voeg 1 ml fibroblast groei media (DMEM + 10% FCS).
11. Wijzig media om de andere dag. Toestaan ​​collageen / fibroblast matrix contract ongeveer 8 dagen, totdat ze passen in een 24-wells schaal (Contractie van ~ 3,5 cm tot 1,5 cm in diameter, zie figuur 1).

Opmerking: De concentratie collageen moet worden aangepast aan de toepassing. Hoe meer Verdun de collageen-oplossing, hoe sneller het zal worden gecontracteerd door de fibroblasten. Kleine verschillen in krimp percentage wordt ervaren met verschillende batches van collageen bij dezelfde concentratie. Ook verschillende fibroblastculturen de collageen gels met verschillende snelheden samentrekken en meer fibroblasten presenteren, hoe sneller de snelheid van contractie. Concentratie en fibroblast collageen dichtheid kan derhalve aangepast aan de snelheid van contractie wijzigenen de uiteindelijke dichtheid van de collageen gel.

4. Fase II - Plating cellen plaats bovenop de matrix

Let op: Steriliseer alle tangen en apparatuur met ethanol voor gebruik.

1. Met behulp van stompe tang, beweeg gecontracteerde matrix 24-well schotel. Zorg ervoor dat dit niet het geval vouwen.
2. Bereid suspensie van cellen plaats bij ongeveer 4 x 10 ⁴ / ml en 1 ml plaat (na trypsinising, spin cellen te ontdoen van trypsine) bovenop de matrix. Werkelijke aantal benodigde cellen afhankelijk van de gebruikte celtype. Celmedium moet normaal kweekmedium voor de cellen van belang.
3. Toestaan ​​cellen tot confluentie groeien bovenop de matrix, ongeveer 3-5 dagen.

5. Fase III - Overdracht van de matrix om een ​​rooster voor een invasie (ongeveer 0 tot 21 dagen)

1. Snijd roestvrij stalen roosters op een statief te maken en voor autoclaaf te gebruiken (zie figuur 2).
2. Plaats steriele net in6 cm schaaltje, voeg groeimedia tot boven het rooster (circa 10.5ml). Plaats matrix op het net en Zuig media zodat de onderkant van de matrix in contact met media, maar niet ondergedompeld. Dit wordt aangeduid als de lucht / vloeistof interface, die een verloop dat invasie bevordert creëert. Vervang medium om de twee dagen (zie figuur 2).
3. Levende cellen kunnen contextuele beeldvorming met fluorescerende cellen worden afgebeeld in dit stadium of eerder. De gecontracteerde of collagenen I kunnen worden afgebeeld met behulp van tweede harmonische generatie (SHG, zie figuur 3). Multi-fotonexcitatie gecombineerd met breedveld detectie we dat SHG kan ten minste 100 urn worden afgebeeld in de matrix, terwijl cellen die GFP cytoplasmatische kan worden afgebeeld ten minste 200 um diep.

Opmerking: Met betrekking tot de kwantificering van invasie, de dag waarop matricies worden geplaatst op de roosters definieert dag 0. Plaatsing op roosters genereert een helling van celcultuur media die invasie int bevordert o de matrix. Monsters kunnen worden afgebeeld op de volgende 1 - 21 dagen (of langer) om biologische processen zoals invasie, proliferatie, overleving of differentiatie (zie referentielijst) beoordelen.

6. Fase IV - Fixatie

1. 5 ml van 4% PFA in een Falcon buis.
2. Breng de matrix op een vlakke ondergrond. Snijd de matrix in de helft met een frisse schone scalpel (zoals u zult de doorsnede zich vlekken), tilt u de matrix met scalpel en transfer naar 4% PFA, fix 's nachts.
3. Organotypische matrices zijn nu klaar om vlek met antilichaam / naar keuze vlek (zie figuur 3).

7. Representatieve resultaten:

Figuur 1 Voorbeeld van fibroblast-gecontracteerde collageen I. Mengsel van fibroblast en rattenstaart collageen los van de petrischaal en mogen contracteren meer dan 6-8 dagen.

Figuur 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
Figuur 2 Organotypische assay progressie. Een schematische opzet van organotypische en progressie. B, Voorbeeld van collageen / fibroblast matrix bovenop roestvrij staal, steriel raster lucht / vloeistof interface.

Figuur 3 Toepassingen van organotypische assay. A, B niet-invasieve en invasieve pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) cellen binnen te vallen na verloop van tijd met organotypische matrix. C, levende huid gelijk met een gestratificeerde epidermis op een fibroblast-gecontracteerde collagene dermale component. D, binnendringende C8161 melanoomcellen zijn om een fibroblast -gecontracteerd collagene dermale equivalent. E, invasieve PDAC cellen (groen) interactie en binnenvallen met fibroblasten (rood) binnen de organotypische matrix. F

Discussion

Hier wordt een werkwijze voor productie van een 3-dimensionale matrix geschikt voor studies van invasieve celmigratie ^6-8. De matrix bestaat uit collageen type 1 fibrillen, die gesloten gedurende verscheidene dagen door primaire humane epidermale fibroblasten. Het collageen wordt bereid door zure extractie, niet enzymatische digestie, die reactiviteit behoudt de poly-peptide uiteinden en bevordert verknoping van collageenvezels in grotere aggregaten na neutralisatie van bufferomstandigheden ^9. Dit resulteert in een gereconstitueerd gel die de eigenschappen van collageen beter nabootst in vivo en heeft grote gevolgen voor de invasieve eigenschappen van cellen gekweekt in de gels. Het maakt niet uit of vers of bevroren uitgangsmateriaal wordt gebruikt, maar het gebruik van adolescente ratten staart is belangrijk, omdat collageen cross-linking is meer labiel bij jongere dieren. Collageen I van jongere dieren is dan ook makkelijker uit te pakken naar, en re-vormt wet een hogere geluidskwaliteit.

Het collageen matrix kan worden gefixeerd en gekleurd met antilichamen gericht tegen invasieve tumorcellen of stromale fibroblasten ^2,10 en zijn zeer nuttig voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen die invasie ^5,6 kunnen staan.

Hoewel dit protocol stelt het gebruik van primaire menselijke huidfibroblasten, is het mogelijk om primaire fibroblasten uit andere weefseltypen, afhankelijk van het type weefsel dat wordt onderzocht. Het is ook mogelijk na te gaan kweken met geïmmortaliseerde fibroblasten, inclusief cellen die stabiel zijn getransfecteerd met fluorescerend eiwit conjugaten. Op deze wijze zowel stromale cellen en tumorcellen kunnen gelabeld cel-cel interacties visualiseren tijdens invasie ^11.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x MEM	GIBCO, by Life Technologies	21430	-
NaOH	Sigma-Aldrich	367176-500G	Prepare 0.22 M stock in water
FCS	PAA Laboratories	A15-101	-
35 mm dishes	Falcon BD	353001	For step 3.4
60 mm dishes	Falcon BD	353004	For step 5.2
Spring forceps blunt	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	E003/02	Toothed, not smooth
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% in PBS prior to use
Screens for cd-1, size 40 mesh	Sigma-Aldrich	S07707-5EA	Stainless steel grids, 5 per pack
Dialysis tubing	Medicell International	7607 2295	12 - 14 kD
PBS	Oxford Labware	BR0014G	-
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	242853	-
24 well dish	Falcon BD	353047	For step 4.1
Fungizone	Invitrogen	15290018	-