Summary
En automatiserad myography metod för kraft mätningar i isolerade mesenteriala artärer beskrivs. Det använder en Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A för att avgöra svar på fenylefrin och extracellulärt kalcium. Metoden gör det möjligt konsekvent bestämning av isometrisk svar agonister i små kärl diameter 60 - 300 um, oberoende av varandra.
Abstract
Proximal motstånd fartyg, såsom mesenteriska artärerna, avsevärt bidra till perifera motståndet. Dessa små fartyg på mellan 100-400 nm i diameter funktion främst i att styra blodflödet till olika organ enligt de övergripande kraven på kroppen. Råttan mesenterica artär har en diameter större än 100 ìm. Den myography tekniken, först beskrevs av Mulvay och Halpern 1, baserades på den metod som föreslagits av Bevan och Osher 2. Tekniken ger information om små fartyg under isometriska förhållanden där betydande förkortning av muskeln beredningen förhindras. Sedan gäller produktion och känslighet av fartyg till olika agonister är beroende på omfattningen av stretch, enligt aktiva spänningar längd förhållande, är det viktigt att genomföra kontraktion studier under isometriska förhållanden för att förhindra överensstämmelse montering kablar. Rostfritt stål är att föredra framför volfram trådar på grund av oxidation av de senare, som drabbar inspelade svar 3. Tekniken gör det möjligt för jämförelse av agonist-inducerad kontraktion av monterade fartyg att få bevis för normal funktion av glatta receptorer muskelcell.
Vi har visat i flera studier att isolerade mesenteriska artärer som är kontrakterade med phenylyephrine slappna av efter tillägg av kumulativa koncentrationer extracellulärt kalcium (Ca 2 + E). Resultaten har lett oss till slutsatsen att perivaskulär sensoriska nerver, som uttrycker G-proteinkopplade Ca2 +-sensing receptor (bil), förmedlar detta vasorelaxation svar. Använda en automatisk metod tråd myography visar vi här att mesenteriska artärer från Wistar, Dahl saltkänsliga (DS) och Dahl salt-resistenta (DR) råttor reagerar olika på Ca 2 + E. Vävnader från Wistar råttor visade högre Ca 2 +-känslighet jämfört med dem från DR och DS. Minskad CAR uttryck i mesenteriala artärer från DS råttor korrelerar med minskad Ca 2 + e-inducerad avslappning av isolerade, pre-kontrakterade artärer. Uppgifterna tyder på att bilen är som krävs för avslappning av mesenteriala artärer under ökad adrenerg ton, som uppstår vid hypertoni, och ange en inneboende defekt i CAR signalväg i Dahl djur, vilket är mycket svårare i DS.
Metoden är användbar för att bestämma vaskulär vivo reaktivitet ex i mesenteriala motstånd artärer och liknande små blodkärl och jämförelser mellan olika agonist och / eller antagonister kan enkelt och konsekvent bedömt sida vid sida 6,7,8.
Protocol
1. Isolering av råttor mesenteriala liten artär
- Bedöva djur med isofluran i en sluten kammare och torka av magen med alkohol.
- Gör en mittlinjen laparotomi att exponera mesenteriska säng.
- Använda sax, ta bort ca 85 cm av tarmen med matning kärlen med den överlägsna mesenterica artär. Skär den proximala änden av intestinal avsnitt nära pylorus och den distala änden nära ileoanal reservoar-coecal korsning. Segment av tarmen är isolerade från råttor som är djupt sövda med isofluran och avlivas genom att öppna bröstkorgen hjärt punktering.
- Placerad censurerade avsnitt i en belagd petriskål med PSS och utföra dissekering av mesenterica artär i rumstemperatur.
- Pin ner den proximala änden av tarmen på höger sida och stiftet ut resten av intestineina moturs (ieproximal slutet på vänster utfodring kärlsystemet på andra sidan av tarmen).
- Dissekera ut grenen II och III segment tillsammans med en bit av den proximala segmentet.
- Dissekera ut venen och isolera artären (med V-formad gren punkten) och rengör det genom att ta bort fett och bindväv. Undvik direkt kontakt med artären genom att dra försiktigt med pincett och skär genom membranet i bindväv.
2. Montering av fartyg
- Klipp två korta segment (≈ 4 cm) av en 40 ìm volfram-fri tråd av rostfritt stål och med en fin pincett, sätt en in i lumen av varje artär noga med att inte skada endotelet. Använd kabeln tips till öppna lumen vid behov. Blod strömma ut från fartyget är ett gott tecken lumen öppnas.
- Fyll myograph kammaren med fysiologisk saltlösning (PSS, mm: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO 4 0,7 H 2 O, 5 NaHCO 3, 1,2 K 2 HPO 4, 1,1 Na 2 HPO 4, 1,0 CaCl 2, 20 HEPES och 5 glukos, pH 7,4) och askorbinsyra (100 M) vid 37 ° C och med hjälp av pincetten försiktigt överföra gängade fartyget segment från petriskål i kammaren vid rumstemperatur och överföra exciderad proximala fartygssegment till myograph kammaren och dra änden längs vajern att mata in den i kärlet. Undvik att sträcka fartyget.
- Säkra den närmaste änden av kabeln moturs under nära fästskruven på höger käke ansluten till mikrometer. Fånga den fria änden av kabeln med pincett och fäst det medurs under långt fästskruven på den högra käke. Se till att fartyget segmentet längs kabeln ligger i klyftan mellan käkarna utan att någon kontakt med käken själv.
- Skruva käkarna isär och rikta in den andra kabeln parallellt med fartyget och sätt in den i bortre änden av lumen. Försiktigt mata kabeln genom lumen av fartyget segmentet i en rörelse med hjälp av redan monterade tråd som guide. Håll kabeln ca 1 cm från fartyget för att undvika att sträcka den under manövern, och undvik att röra endotelet.
- Skruva käkar tillsammans och se till att den andra monteras tråden flyttas under den första säkrade på den högra käke.
- Säkra nära slutet av andra tråden i medurs riktning under den närmaste fästskruven i vänstra käken ansluten till givaren.
- Säkra den bortre änden av kabeln under fästskruven på den vänstra käken och dra för att sträcka kabeln.
- När monteringen är klar, nollställ motorn i "Montering Meny" och börja normalisering av fartyget.
3. Normalisering
Auto Dual Wire Myograph System-510A har en automatiserad normalisering funktion, vilket bedöms från "normalisering" menyn och låter det fartyg som skall sträcks till en normaliserad intern omkretsen av ett standardiserat förfarande enligt tillverkarens protokollet efter jämvikt i 30 min vid 37 ° C. En exponentiell kurva sedan monteras på interna data omkrets tryck. Förfarandet definierar lumen diametern (d 100) att artär skulle ha haft in vivo när avslappnad och under en transmural tryck på 100 mmHg 1 Normaliseringen parametrarna för råtta mesenterica artär är följande.:
- Mål transmural tryck = 13,3 kPa (100 mm Hg).
- Tid = 60 sek; varaktighet varje normalisering steg.
- IC 1 / IC 100 = 0,9 (IC 1 = normaliserad interna omkrets, IC-100 = intern omkrets motsvarar målet tryck.
- Okular kalibrering 2 * Δ (mm / okulär division), 2 delta är för programmering skäl.
Mät längden på den monterade mesenterica artär med hjälp av mikroskop okular avläsningar när hairlines är över när och fjärran ändar monteras fartyget segmENT. Kortfattat, är längden på den monterade fartygssegment mäts vid maximal förstoring med en kalibrerad okulär okular i dissekering mikroskop. Ögat stycke läsning med hår-line över den bortre änden av segment (en 1) och nära slutet av segment (en 2) i okulär divisioner mäts och registreras. Dessa värden, med mikrometer avläsningar, är före och efter stretching fartyget registreras och förs in i menyerna för programmet att beräkna monteras kurvan och innerdiameter motsvarar ett mål transmural tryck på 100 mm Hg
I våra studier var artärerna in på lumen diameter d 1 = 0,9 xd 100, där aktiv kraft utveckling är maximal. Aktiv kraft utveckling av ≥ 10 mN i artärerna råtta mesenteriala anses optimala för experiment för att fortsätta. Vävnader med lägre aktiv kraft tagits bort.
4. Mätning av svaren
Efter normalisering är de mekaniska och funktionella egenskaper fartyg återaktiveras genom att utföra en "standard start", vilket innebär utmanande fartyg med upprepade ansökningar (normalt 2 eller 3) av 5 mikroM fenylefrin (PE) för att erhålla reproducerbara sammandragningar. En typisk "standard start" i vårt laboratorium består av en serie av stimuli och perioder wash-out enligt följande:
- Byt myograph lock och börja luftning med 95% luft och 5% CO 2.
- Fyll kammare med färska PSS (innehållande 100 surt mikroM askorbinsyra)
- Kontrakt fartyg med 5 mikroM PE i 5 minuter och tvätta fyra gånger med PSS buffert.
- Efter den sista tvättningen, fylla kammaren med PSS och vänta 3 minuter innan du upprepar steg (ii) och (iii).
Efter standarden start är artären redo för experimentet. Lättnader av kontrakterade fartyg bedöms av kumulativa tillsats av ökande halter av CaCl 2 (0,5 - 4 mm). När hämmare används fartygen är redan inkuberas med föreningar i myograph kammaren i 20 min och närvarande under testerna.
5. Data Analysis
Den "normalisering" data för fartyg och tracings kraft direkt konverteras till textdata analyserades med SigmaPlot 11,0 grafritande program (Systat Software, Point Richmond, Kalifornien) och ritas som visas i figur 1. Koncentration-respons-data, räknat från den tracings, analyserades genom bestämning av EC 50 värden från experimentella data monteras på en fyra-parameter logiska funktion i farmakologi menyn i programmet. Jämförelser mellan grupper och inom grupper utfördes av One Way variansanalys (ANOVA) och skillnader med p <0,05 anses vara betydande.
6. Representativa resultat:
| Parametrar | Wistar | Dahl saltkänsliga | Dahl Salt-resistenta |
|---|---|---|---|
| L 100 (mikrometer) | 83,26 ± 2,33 | 91,52 ± 4,67 | 117,45 ± 8,43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| r 2 | 0,99 ± 0,003 | 0,97 ± 0,008 | 0,97 ± 0,007 |
* Skillnaden mellan L 100 värden för Wistar och DR är statistiskt signifikanta. Shapiro-Wilks Normalitet godkänns testet (p = 0,588); Equal Variance Test passerat (p = 0,237).
L 100 = inre diameter monterad segmentet motsvarar målet transmural trycket.
X 1 = mikro lägesställaren inställning som krävs för att sträcka ut den monterade fartyget till dess normaliserade interna omkrets (det vill säga värdet av mikrometer läsa där försök utfördes).
r 2 = regressionskoefficient för passning av (X i, Y i) att en exponentiell kurva.
OBS: Närmare bestämmelser om förfarandet beskrivs i handboken för 510A Myograph System 6.
Tabell 1. Exempel på avläsning av normalisering parametrar för mesenterica artär segment från Wistar, DS och DR från Basic-program som visas i "Normalisering Meny". Värden är medel (± SEM) av 5 djur. * Skillnader mellan L 100 värden för Wistar och DS är statistiskt signifikant (p <0,05).
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14,2 ± 0,6 | | 20,9 ± 1,3 * | |
Tabell 2. Utvecklad spänningar (MN) i mesenteriala artärer isolerade från Wistar, DS och DR råttor efter tillämpningar av 5 mikroM PE till varje fartyg. Redovisade värden är medel (± SEM) på 6-8 djur. * Signifikant från Wistar kontroller (p <0,05).
Figur 1. Ca 2 + e-inducerad uppmjukning av ett PE-kontrakterade mesenterica artär från en Wistar råtta monterad i en tråd myograph i fysiologisk saltlösning som innehåller 1 mM Ca 2 +. Artären var jämvikt i 30 minuter vid 37 ° C med konstant luftning och svar till Ca 2 + e fastställas. En representant kraft spåra om tillsättning av 5 mikroM PE följt av kumulativa tillägg av Ca 2 + visas.
Figur 2. Ca 2 + e-inducerad uppmjukning av ett PE-kontrakterade mesenterica artär från en DS råtta monterad i en tråd myograph i fysiologisk saltlösning som innehåller 1 mM Ca 2 +. Artären var jämvikt i 30 minuter vid 37 ° C med konstant luftning och svar till Ca 2 + e fastställas. En representant kraft spåra om tillsättning av 5 mikroM PE följt av kumulativa tillägg av Ca 2 + visas. Ca 2 + avkoppling var kraftigt nedsatt hos denna vävnad jämfört med dem från Wistar och DR råttor.
Figur 3. Ca 2 + e-inducerad uppmjukning av ett PE-kontrakterade mesenterica artär från ett DR-råtta monterad i en tråd myograph i fysiologisk saltlösning som innehåller 1 mM Ca 2 +. Artären var jämvikt i 30 minuter vid 37 ° C med konstant luftning och svar till Ca 2 + e determined.A representativ kraft spåra om tillsättning av 5 mikroM PE följt av kumulativa tillägg av Ca 2 + visas.
Figur 4. A. [Ca 2 +] e-respons-kurvor. B. stapeldiagram som visar EC 50-värden för avkoppling bestäms genom att montera data till en fyra parameter logistisk curve.C.CaR uttryck i mesenteriala spelhallar isolerade från DR och DS råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hypertoni är en ledande orsak till hjärt-, cerebral och nedsatt sjuklighet / dödlighet. Förekomsten av hypertoni är hög i befolkningen och saltkänsliga hypertoni är särskilt hög i den åldrande befolkningen och vanligare hos svarta än vita. Detta tros bero på en tendens av svarta behålla natrium i njurarna 9. Salt-känsligheten är en stor bidragande orsak till njursjukdom och förknippas med endoteldysfunktion, men mekanismen är inte helt klarlagd. Nyligen genomförda studier i vårt laboratorium har visat att hög salt-dieter minska interstitiell vätska Ca 2 + koncentrationen ([Ca 2 +] IF) samt öka det systoliska trycket i saltkänsliga råttor 10,11. Dessa effekter kan hänföras till minskat uttryck av bilar i mesenteriala artärer och kidneys.Finding liknande minskningar av CAR nivåer i saltkänsliga hypertensiva patienter skulle kunna ge ett mål för utvecklingen av nya behandlingsmetoder. Vi har använt den automatiska tråd myography med isolerad mesenteriska artärer från ett antal djurmodeller av hypertoni för att studera vaskulär reaktivitet till Ca 2 + e för att förstå mekanismen av CAR signalering i kärlsystemet.
[Ca 2 +] e bibehålls inom ett snävt intervall (från 1,1 till 1,4 mM) hos människor 12, måste därför bilen vara kunna upptäcka små förändringar i [Ca2 +] e för aktivering av receptorn ska vara möjlig. I själva verket har bilen visat att upptäcka små förändringar i Ca 2 + e 13, och små ökningar av [Ca2 +] Om det är inom den fysiologiska intervall 14. In situ mikrodialys studier mäter [Ca 2 +] IF i duodenal submucosa och njure cortex, två vävnader som är nödvändiga för reglering av perifert motstånd och blodtryck (BP), visade dynamiska förändringar som en funktion av tarmen lumen [Ca 2 +]. Ökad gut [Ca 2 +] 0 till 6 mM ökade [Ca2 +] IF 1,1 till 1,9 mM 4,5,15, vilket är i det intervall som observerats för att aktivera perivaskulär nerven CAR 16, och koppla av isolerade mesenteriska artärer 17. Vi har också visat att bilen känner av minskningar i [Ca2 +] e och öka aktionspotentialens duration genom aktivering av icke-selektiva ning kanal, som i sin tur dämpar effekten på utsläpp sannolikhet vid hjärnbarkens terminaler 18. Detta tyder på att CAR ger presynaptisk feedback för att förändra hjärnans retbarhet som svar till Ca 2 + E. Dessutom sker hyposensibilisering av PvN bilen med upprepad, långvarig stimulering 16, vilket tyder på att en förståelse av regleringen av denna receptor kommer att klargöra sin roll under både normala och hypertensiva tillstånd. Bukoski och kollegor har visat att små förändringar i [Ca2 +] IF är tillräckligt för att aktivera bilens och bidra till vasodilaterande syntes under normala förhållanden 3,4.19,. Baserat på dessa iakttagelser, postulerar vi att detta svar även kommer att ske under förhållanden av ökad kärltonus som observerats vid hypertoni och kan därför utnyttjas för att kontrollera blodtrycket. Studiet av CAR aktivering och hur detta leder till fosforylering av signalering intermediärer är därför skyldig att undersöka sin roll i normal och hypertensiva fysiologi. Bilen är G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och regleras genom liknande mekanismer som andra GPCRs, som är gemensamma terapeutiska mål. Därför kommer förstå mekanismerna för dess reglering i blodkärlen ge användbara uppgifter för att fastställa dess potential som ett mål för antihypertensiv terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Projektet beskrivs stöddes av utmärkelsen Numbers R01 HL064761, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 och P20 MD000175 bilda National Institutes of Health. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigating of small vessels using small vessel myograph. DMT Danish Myo Technology. , (2004).
- Angus, J. A., Wright, C. E. Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44, 395-407 (2000).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. J. Physiol. 275, 85-101 (1978).
- Lindhorst, J., Alexander, N., Blignaut, J., Rayner, B. Differences in hypertension between blacks and whites: an overview. Cardiovasc. J. Afr. 18, 241-247 (2007).
- Eley, S. L., Allen, C. M., Williams, C. L., Bukosi, R. D., Pointer, M. A. Action of thiazide on renal interstitial calcium. Am. J. Hypertens. 21, 814-819 (2008).
- Palmer, C. E., Rudd, M. A., Bujoski, R. D. Renal interstitial Ca2+ during sodium loading of normotensive and Dal-salt hypertensive rats. Am. J. Hypertens. 16, 771-776 (2003).
- Hurwitz, S. Homeostatic control of plasma calcium concentration. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 41-100 (1996).
- Brown, E. M., MacLeod, R. J. Extracellular sensing and extracellular calcium signaling. Physiol. Rev. 81, 239-297 (2001).
- Breitwieser, G. E. Extracellular calcium as an integrator of tissue function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 1467-1480 (2008).
- Mupanomunda, M. M., Wang, Y., Bukoski, R. D. Effect of chronic sensory denervation on Ca2+-induced relaxation of isolated mesenteric resistance arteries. Am. J. Physiol. 274, 1655-1661 (1998).
- Mupanomunda, M. M., Ishioka, N., Bukoski, R. D. Interstitial Ca2+ undergoes dynamic changes sufficient to stimulate nerve-dependent Ca2+-induced relaxation. Am. J. Physiol. 276, 1035-1042 (1999).
- Mupanomunda, M. M., Tian, B., Ishioka, N., Bukoski, R. D.
- Awumey, E. M., Hill, S. K., Diz, D. I., Bukoski, R. D. Cytochrome P-450 metabolites of 2-arachidonoylglycerol play a role in Ca2+-induced relaxation of rat mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2363-2370 (2008).
- Chen, W., Bergsman, J. B., Wang, X., Gilkey, G., Pierpoint, C. R., Daniel, E. A., Awumey, E. M., Dauban, P., Dodd, R. H., Ruat, M., Smith, S. M. Presynaptic external calcium signaling involves the calcium-sensing receptor in neocortical nerve terminals. PloS One. 5, e8563-e8563 (2010).
- Bukoski, R. D. The perivascular sensory nerve Ca2+ receptor and blood pressure regulation: a hypothesis. Am. J. Hypertens. 11, 1117-1123 (1998).
- Bukoski, R. D. Dietary Ca2+ and blood pressure: evidence that Ca2+-sensing receptor activated sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca2+ with vascular. 16, 218-221 (2001).
