Method Article

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

DOI:

10.3791/3168

⸱

July 9th, 2011

 ,  , 
1Defence Medical and Environmental Research Institute, DSO National Laboratories, 2Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Graduate Medical School, 3Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Graduate Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستفادة من التقدم في مجال التنمية وfluorophore تكنولوجيا التصوير ، وهي طريقة بسيطة لوضع العلامات اليكسا فلور من حمى الضنك ولقد ابتكر الفيروس لتصور التفاعلات المبكرة بين الفيروس والخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن للأحداث في وقت مبكر من التفاعل بين الفيروس والخلية لها تأثير عميق على نتيجة العدوى. ويمكن تحديد العوامل التي تؤثر على هذا التفاعل يؤدي إلى تحسين فهم المرض والتسبب بالتالي التأثير على تصميم أو لقاح علاجي. وبالتالي ، فإن تطوير وسائل لتحقيق هذا التفاعل مفيدا. ويمكن استغلال التطورات الأخيرة في التنمية fluorophores 1-3 و تكنولوجيا التصوير 4 إلى تحسين معرفتنا الحالية على المرضية بحمى الضنك ، وبالتالي تمهيد الطريق للحد من الملايين من الإصابات بحمى الضنك التي تحدث سنويا.

فيروس حمى الضنك يلفها له سقالة الخارجية التي تتكون من dimers المغلف 90 (E) بروتين سكري حماية قذيفة nucleocapsid ، الذي يحتوي على حبلا واحدة إيجابية رنا الجينوم 5. وبالتالي يمكن أن مفارز متطابقة البروتين على سطح الفيروس يكون المسمى مع صبغة an رد الفعل من خلال تصور وأمين المجهري مناعي. هنا ، نقدم طريقة بسيطة لوضع العلامات لفيروس حمى الضنك مع اليكسا فلور succinimidyl استر الصبغة الذائبة مباشرة في بيكربونات الصوديوم العازلة التي أسفرت عن الفيروس مجدية للغاية بعد وضع العلامات. لا توجد إجراءات موحدة لوضع العلامات على فيروسات حية والبروتوكول الصانع القائمة لوضع العلامات البروتين وعادة ما يتطلب إعادة تشكيل الصبغة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل. وجود ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، حتى بكميات صغيرة ، يمكن منع العدوى من فيروس الإنتاجية وتحفز أيضا السمسة 6 خلايا. استبعاد استخدام سلفوكسيد ثنائي ميثيل في هذا البروتوكول وبالتالي تقليل هذا الاحتمال. الكسا الأصباغ فلور وصمود للضوء متفوقة ودرجة الحموضة أقل حساسة من الأصباغ المشتركة ، مثل فلوريسئين ورودامين 2 ، مما يجعلها مثالية لإجراء دراسات عن امتصاص الخلوية والنقل endosomal الفيروس. لم اقتران اليكسا فلور صبغة لا يؤثر على الاعتراف الفيروس المسمى بفيروس حمى الضنك ، ومستقبلات محددة الأضداد المفترضة لها في الخلايا المضيفة 7. هذا الأسلوب يمكن أن تكون لها تطبيقات مفيدة في الدراسات الفيروسية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الكسا فلور توسيم فيروس حمى الضنك

  1. رد الفعل قبل وضع العلامات ، وتنقية فيروس حمى الضنك مع وسادة السكروز وتحضير الكواشف والمعدات اللازمة كما هو مبين في البروتوكول.
  2. اعداد جديدة بيكربونات الصوديوم 0.2M العازلة ، ودرجة الحموضة 8.5 (الوسم العازلة) ، وهيدروكسيل 1.5M العازلة ، ودرجة الحموضة 8.3 (وقف كاشف) ، قبل وضع العلامات وتصفية تعقيم المحاقن مع مرشحات 0.2μm.
  3. تمييع وحدات اللوحة حوالي 8 تشكيل 3x10 (pfu) من فيروس حمى الضنك في تنقية 1ml ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن استخدام صبغة AF594 في هذا التقرير ، مجموعة واسعة من fluorophores في سلسلة فلور اليكسا استرات succinimidyl يتوفر مع العلامات الكيمياء مماثلة. ويمكن توسيع نطاق تطبيق هذا الوسم خارج التصوير. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي كبديل للمبائر المجهري لتقدير درجة لوسم fluorophores التي يمكن الكشف عنها بواسطة متحمس والجهاز FACS.

الكسا الأصباغ فلور هي عبارة عن جزيئات صغيرة تتفاعل مع المجموعات الأمينية الحرة ، في.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، وسنغافورة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
بيكربونات الصوديوم سيغما الدريخ S6297
هيدروكسيل سيغما الدريخ 159417
هيدروكسيد الصوديوم ميرك 106498
AF594 استرات succinimidyl المسابر الجزيئية ، Invitrogen A20004
PD - 10 عمود جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-0851-01
Hepes سيغما الدريخ H6147
كلوريد الصوديوم سيغما الدريخ S3014
EDTA سيغما الدريخ E9884
M - 199 Invitrogen 11150
FBS Hyclone SH30070.03
4 كذلك لوحة نونك 176740
Coverslips Einst 0111520
شريحة المجهر الشراع العلامة التجارية 7105
3H5 ورم هجين ATCC HB46
10X PBS 1 قاعدة BUF - 2040 - 10X1L
سابونين سيغما الدريخ S4521
BSA سيغما الدريخ A7906
كلوريد المغنيسيوم سيغما الدريخ M2670
كلوريد الكالسيوم سيغما الدريخ C3306
Paraformaldehye سيغما الدريخ 15،812-7
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Dabco سيغما الدريخ D27802
منضدية الطرد المركزي إيبندورف 5424
مبائر المجهر زايس LSM 710

لإعداد M - 199 متوسطة النمو ، إضافة 50ml من FBS ، 5ml من البيروفات الصوديوم و5ml من غير الضروري من الأحماض الأمينية إلى 500ml من طراز M - 199 ، تصفية العقيمة.

لإعداد M - 199 متوسطة الصيانة ، إضافة 15ml من FBS ، 5ml البيروفات من الصوديوم و5ml من غير الضروري من الأحماض الأمينية إلى 500ml من طراز M - 199 ، تصفية العقيمة.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
  2. Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield excep....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dengue Virus LabelingAlexa Fluor DyeImmunofluorescence AssaySize Exclusion ColumnPlaque AssayFluorescent MicroscopyVirus PurificationCellular UptakeEndosomal TransportColocalization Analysis

Related Articles