Summary
Photolyse von caged-Verbindungen ermöglicht die Produktion von schnellen und lokalisierten Anstieg der Konzentration von verschiedenen physiologisch aktiven Verbindungen. Hier zeigen wir, wie Patch-Clamp-Aufnahmen mit der Photolyse von caged cAMP kombiniert oder caged Ca für das Studium der olfaktorischen Wahrnehmung in dissoziierten Maus Riechzellen erhalten.
Abstract
Photolyse von caged-Verbindungen ermöglicht die Produktion von schnellen und lokalisierten Anstieg der Konzentration von verschiedenen physiologisch aktive Verbindungen 1. Caged-Verbindungen sind Moleküle aus physiologisch inaktiv durch eine chemische Käfig, der durch einen Blitz von UV-Licht gebrochen werden kann. Hier zeigen wir, wie Patch-Clamp-Aufnahmen mit der Photolyse von caged-Verbindungen für das Studium der olfaktorischen Wahrnehmung in dissoziierten Maus Riechzellen kombiniert zu erhalten. Der Prozess der olfaktorischen Wahrnehmung (Abbildung 1) erfolgt in den Cilien von Riechzellen, wo Geruchsstoff Bindung an Rezeptoren führt zu einer Erhöhung der cAMP, dass zyklische Nukleotid-gesteuerte (CNG)-Kanäle 2 öffnet. Ca Eintrag durch CNG-Kanäle aktiviert Ca-aktivierte Cl-Kanäle. Wir zeigen, wie die Neuronen aus dem olfaktorischen Epithel der Maus 3 und wie CNG-Kanäle oder Ca-aktivierte Cl-Kanäle durch Photolyse von caged cAMP 4 oder caged Ca 5 aktivieren distanzieren </ Sup>. Wir verwenden eine Blitzlampe 6,7 gegenüber UV-Blitze, die Ciliargegend gelten Uncage cAMP oder Ca während Patch-Clamp-Aufnahmen getroffen werden, um den Strom in der whole-cell Voltage-Clamp-Konfiguration 8-11 messen.
Discussion
Flash-Photolyse von caged Verbindungen mit Patch-Clamp-Aufnahmen kombiniert ist eine nützliche Technik, um schnelle und lokale Sprünge in der Konzentration der physiologisch aktive Moleküle sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zellen zu erhalten. Mehrere Arten von Käfigen Verbindungen1 wurden synthetisiert, und diese Technik kann auf verschiedene Arten von Zellen, einschließlich kultivierten Zellen, die Ionenkanäle, die aktiviert oder moduliert werden durch Photolyse von einigen der verfügbaren caged Verbindungen 11 angewendet werden kann.
Photolyse von caged Verbindungen erfordert Pulse hoher Intensität von nahem UV-Licht, eine ausreichende Menge von Molekülen in einer kurzen Zeit Uncage. Verschiedene Lichtquellen können verwendet werden: eine kontinuierlich betriebene Quecksilber-oder Xenon-Bogenlampe durch eine Blende gesteuert und gekoppelt an die epifluoreszenten Anschluss des Mikroskops, einer Xenon-Blitzlampe, einem UV-Laser und der neu entwickelten Hochleistungs-UV-Licht emittierenden Diode (LED ). Jede Art von Lichtquelle hat Vor-und NachteileVorteile nach der spezifischen Anwendung und zu den Kosten des Apparats. Im Vergleich zu einer Blitzlampe, die kontinuierlich betriebene Lampen eine geringere Lichtintensität und damit die Dauer der Lichtimpulse durch einen Shutter gesteuert muss bis zu mehreren hundert ms erhöht werden, um eine ausreichende Menge an uncaged Moleküle zu erhalten. UV-Laser sind sehr teuer. High Power UV-LEDs 14 für Blitzlichtphotolyse sind vor kurzem im Handel erhältlich und könnte eine gute Alternative zu anderen Methoden liefern. Allerdings ist ein Vorteil von Blitzlampen, dass sie ein breiteres Emissionsspektrum als UV LEDs haben, was die Verwendung verschiedener Arten von caged Verbindungen mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften Die wichtigsten Vorteile auf einen Xenon-Blitz-Lampe für Uncaging in unserer Anwendung sind: eine gute Zeitauflösung in der Tat die Dauer der Lichtpulse ist etwa 1 ms, ein breites UV-Spektrum, die sich für die Photolyse von Molekülen mit verschiedenen photochemischen Eigenschaften ist, die Möglichkeit, die dime wählennsion der Lichtfleck auf die Ciliargegend beleuchten; die Möglichkeit, einfach auswählen verschiedenen Lichtintensitäten 6. Darüber hinaus die Xenon-Blitz-Lampe mit vertretbarem Aufwand hat, ist es leicht in eine elektrophysiologische Set-up implementiert und erfordert keine besondere Wartung.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
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