ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

Summary

הליך פשוט של ביצוע ניסויים אישית microarray microRNA מתואר. הצעדים כוללים בידוד RNA, תיוג RNA ו-DNA התייחסות, והכלאה דגימות כדי microarrays, סורקת את microarrays, כימות וניתוח אותות הכלאה.

Abstract

רנ"א (miRNAs) הם משפחה גדולה של ~ 22 נוקלאוטידים (NT) זמן מולקולות RNA אשר באים לידי ביטוי נרחב אאוקריוטים ^1. הגנום מורכב לקודד לפחות מאות miRNAs, אשר בראש ובראשונה לדכא את הביטוי של מספר רב של גני מטרה שלאחר transcriptionally ^{2, 3.} miRNAs לשלוט במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים ^1. בנוסף, הביטוי מירנה שינה נמצא קשור מחלות אנושיות, כגון סרטן, ואת miRNAs עשוי לשמש סמנים למחלות הפרוגנוזה ^{4, 5.} חשוב, אפוא, להבין את הביטוי פונקציות של miRNAs בתנאים שונים.

שלוש הגישות העיקריות היו מועסקים לביטוי פרופיל מירנה: PCR בזמן אמת, microarray, וסדר עמוק. הטכניקה של microarray מירנה יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה, בדרך כלל פחות יקר, ורוב הפעולות הניסוי וניתוח ניתן קארied החוצה במעבדה לביולוגיה מולקולרית במרבית האוניברסיטאות, בתי ספר לרפואה ובתי חולים הקשורים. כאן, אנו מתארים שיטה לביצוע אישית microarray ניסויים מירנה. מערכת בדיקה מירנה יודפסו על שקופיות זכוכית כדי לייצר microarrays מירנה. רנ"א הוא מבודד באמצעות שיטה או מגיב ששומרת קטן מינים RNA, שכותרתו אז עם צבע פלואורסצנטי. כמו שליטה, DNA התייחסות oligonucleotides המקביל משנה של miRNAs מסומנים גם עם צבע פלואורסצנטי שונים. ה-DNA התייחסות ישמש כדי להדגים את האיכות של השקופית ואת ההכלאה ואת ישמש גם לנורמליזציה נתונים. רנ"א ודנ"א הם מעורבים הכלאה לשקופית המכילה microarray בדיקות עבור רוב miRNAs במסד הנתונים. לאחר הכביסה, להחליק את נסרק להשיג תמונות, בעוצמות של מקומות מסוימים לכימות. אותות אלה הגלם יעובדו נוסף ניתח את הנתונים ביטוי miRNAs המקביל. Microaמגלשות rray ניתן הפשיטו מחדש כדי להפחית את העלות של microarrays כדי לשפר את העקביות של ניסויים microarray. אותם עקרונות ונהלים החלות על סוגים אחרים של ניסויים microarray אישית.

Protocol

1. הדפסה של microarrays מירנה אישית

1. הדפס את השקופיות microarray באמצעות מתקן הגרעין שירותי microarray באוניברסיטה או חברה. איכות ייצור microarray היא אחד הגורמים הקריטיים ביותר להצלחה של הניסוי microarray. נסו כמה שירותים במידת האפשר. באופן אידיאלי, אפשר היה להדפיס שקופיות 5-10 בכל פעם, ואת כל השקופיות ייראה זהה, עם כתמים בודדים מופרדים היטב.
2. לקבלת תמיכה microarray, אנו משתמשים פערים שקופיות השנייה מצופה.
3. עבור בדיקות מירנה, אנו משתמשים NCode Multi-Species מירנה microarray בדיקה קבע V2.
4. ממיסים את כל oligonucleotides ב 3 x SSC ב 10 מיקרומטר ו quadruply להדפיס אותם על השקופיות. תקן את השקופיות על ידי הקרנה אולטרה סגולה על פי הוראות השקופיות II GAAPS. לייבל השקופית באמצעות עט יהלום לסמן את האזור לצד בדיקות מודפס. חנות ב 22 ° C.

2. לדוגמה הכנה

1. כל שיטהאו מגיב יכול לשמש כדי לבודד RNA, כל עוד היא שומרת RNA קטנים. אנו משתמשים בדרך כלל Trizol (Invitrogen) כדי לחלץ RNA בסך הכל, עם כמות איכות משביעת רצון של ההכנות RNA, כפי שנמדד על ידי _260nm ו _280nm קריאות.
2. עבור RNA תיוג, לערבב ~ 25 מיקרוגרם של רנ"א מוחלטת עם 0.5 מיקרוגרם של 5'-PCU-DY547-3 ^"6 במאגר x 1 (50 HEPES מ"מ, pH 7.8, 20 מ"מ MgCl _2, 10 מיקרוגרם / מ"ל BSA, 10% DMSO) המכיל ~ 20 יחידות T4-RNA האנזים 1, בתוספת ~ 10 mM DTT ו ~ 0.02-0.03 נפח הסופי של 10 x T4 חיץ RNA האנזים 1 עבור ה-ATP.
3. אפשר תיוג להמשיך על הקרח בתוך המקרר במשך 2-24 שעות. המשקע RNA עם אצטט 0.3 M נתרן 3 כרכים של אתנול. עבור קשירת משקעים יעיל, לפזר RNA סך של מעל 2 מ"ג / מ"ל, ולשמור את נפח קשירת הכולל ב μl 20 ~.
   1. אם RNA פחות זמין, כמות קלט 5'-RNA ו-PCU DY547-3 "יכול להיות scaled למטה. </ Li>
   2. אם RNA הוא מאוד דליל, להוסיף המוביל כגון tRNA שמרים לסייע משקעים.
4. שלב ו התווית מיקרוגרם 1 סך של DNA oligonucleotides התייחסות המקביל משנה של miRNAs יונקים באמצעות Ulysis אלקסה פלואוריד 647 חומצות גרעין תיוג קיט ⁶ כביקורת על תהליך ההכלאה. לטהר את ה-DNA מסומן באמצעות טור CentriSep ולשמור בחושך ב -20 ° C.

3. Microarray הכלאה

1. כדי להשתמש שקופיות בפעם הראשונה, לפני להכליא את השקופיות בפתרון מסונן של 3 x SSC, 0.1% SDS, BSA 0.2% במשך 30-60 דק 'ב 37 ° C. להטביע אותם במים כמה פעמים, אז isopropanol. יבש את השקופיות בעזרת צנטריפוגה עם מתאם שקופיות ב 100 גרם במשך 5 דק 'ב 22 ° C.

הערה: אנו משתמשים בתאי קורנינג microarray הכלאה ו mSeries אירי של המדעית של Lifterslips לבצע הכלאה microarray.

2. שוטפים את lifterslips במים, אז אתנול, לפני ייבוש באוויר. המקום שקופיות בתוך בסיס קאמרית הכלאה microarray, וכן lifterslip על גבי השקופית. Lifterslip יכסה את אזור הבדיקה, עם רצועות לבן שלה לפנות את השקופית.
3. בחושך, ספין למטה זירז, רנ"א מסומן. לשטוף את זה פעם אחת עם 70% אתנול, ו אוויר יבש גלולה. גלולה צריך להיות אדמדם.
4. הכן פתרון הכלאה המכיל 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7.0, 0.8% BSA, 5% SDS, לפוראמיד 12% עם ⁶ μl 1/15-1/100 של מטוהרים, שכותרתו התייחסות DNA (2.4) לדגימה RNA. כמות ה-DNA התייחסות הוסיף תלוי כמה oligonucleotides שונים מסומנים (2.4). אם יש מעל 100, אז דילול פחות נחוץ.
5. ממיסים את גלולה RNA היטב עם μl 60 ~ הפתרון הכלאה.
6. הוסף 20 μl של מים לכל אחד בארות humidifying על בסיס microarray קורנינג קאמרית הכלאה.
7. הוסף tהוא תערובת של RNA ו-DNA שכותרתו הפניה לשקופית. השתמש טיפ pipet דק, לגעת בעדינות את קצה lifterslip, ולאפשר פתרון להיכנס רווח בין lifterslip והחלק דרך יניקה.
8. הנח את מכסה תא הכלאה מעל לבסיס, ואז לאטום את החדר עם קליפים מתכת.
9. שים את החדר כולו בתוך שקית הפלסטיק שמגיע עם קלטת הקאמרית של קורנינג.
10. מניחים את קלטת קאמרית (ים) בתוך מכולה עם מגבת נייר הרטובות; לכסות את המיכל בניילון נצמד ומניחים אותו בתוך 37 ° C לחות, תא תרבות חממה ~ 24 שעות. אלו אמצעי זהירות (3.6, 3.9, 3.10) להבטיח כי הפתרון הכלאה לא להתייבש במהלך הדגירה.

4. פוסט הכלאה עיבוד

1. לפרק את קלטות תא אחד אחד. שקופית לצלול lifterslip שלה 2 x SSC ב 22 ° C. Lifterslip באופן טבעי ליפול השקופיות. המקום בו 0.8 x SSC. לשטוףאת השקופיות ב 0.8 x SSC פעמיים, ואז שלוש פעמים 0.4 x SSC, 1-2 דקות בסך הכל. יבש את השקופיות בעזרת צנטריפוגה עם מתאם שקופיות. שטפו את lifterslips במים ולשמור לשימוש חוזר מאוחר יותר.
2. סרוק את השקופיות עם סורק כל מתאים, למשל, פרקין אלמר ScanArray 5000 או מולקולרית התקנים אקסון GenePix סורק 4000B microarray. סריקה באורכי גל קרובים 547 ננומטר 647 ננומטר כדי להשיג את קבצי התמונה המתאימה.
3. שימוש תוכניות כגון BlueFuse לכמת בעוצמות פיקסל קלט, קבצי תמונה מ 4.2). בדוק מקומות מסוימים עם התוכנית להוציא נקודות חריגות על microarrays מתוך שיקול נוסף. אלה כתמים נורמלי בדרך כלל נובעים הדפסה מחליקים מחליקים עניים או טיפול לאחר ההכלאה.
4. שימוש תוכניות כגון GeneSpring ו-Excel לניתוח נתונים והצגה. שיקולים כלליים לנורמליזציה נתוני microarray חלים, המהווה מעבר להיקף של מאמר זה.
5. לאחר אותות משביע רצון מתקבלים after 4.3), רצועת שקופיות microarray לשימוש חוזר ^7. יש לשטוף את השקופיות במים, לטבול אז מראש חימם, 1 mM NaOH ו 0.1 x SSC בצלחת מכתים ב 62 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות. חזור על דגירה פעם אחת. לשטוף את השקופיות כמה פעמים במים עד 60 דקות עם רעד עדין על 22 ° C. יבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגות, ולאחסן על 22 ° C.
6. כדי להשתמש מחדש בשקופיות, אין צורך לאשר מראש את להכליא אותם שוב. פשוט לשטוף אותם במים ואחריו isopropanol, ויבש השקופיות ממש לפני ההכלאה.

5. נציג תוצאות:

יש לנו בעיקר בעקבות ההליכים המתוארים לפרופיל ביטוי מירנה העולמי אלפי דגימות, כלומר RNAs מבודד דג הזברה כדי הדגימה האדם בתנאים שונים. איור 1 מציג תמונה סרוקה של microarray להפגין אותות הכלאה מדויקת מאוד חזק על שקופית. פירסון correlatiעל מקדמי בין טכני משכפל של הכלאה microarray הם ~ 0.99 ^7, המציין reproducibility מעולה.

איור 1 תמונה Composite של שקופיות microarray סרוקים מירנה לאחר ההכלאה. כתמים אדומים נבעה הכלאות על ידי ה-DNA התייחסות, כתמים ירוקים מן המדגם RNA DY547 שכותרתו, בעוד כתמים צהובים היו הכלאות על ידי ה-DNA ו-RNA הן על בדיקות זהה.

Discussion

למרות ההתקדמות עמוק טכנולוגיות רצף, microarray נשאר בחירה מעשית עבור ניתוח תפוקה גבוהה של DNA ו-RNA. בהשוואה רצף עמוק, ניסויים microarray זולים, וכן מעבדה לביולוגיה מולקולרית טיפוסי יכול לבצע את רוב הניסויים ניתוח נתונים בתוך הבית, אשר מאפשר גמישות חוסך זמן. בעתיד, סביר להניח microarrays היטב המותאם באופן אינטנסיבי לחקור קבוצות הגנים, למשל, או כל קבוצת משנה של גורמי תעתוק בגנום או miRNAs, ואת אותם עקרונות ונהלים שהוצגו כאן ניתן להשתמש בניסויים microarray מנהג ללמוד הגן משפחות מלבד miRNAs. כמובן, החיסרון העיקרי הוא כי על microarrays מידע רצף חייב להיות זמין מראש. זו לא בעיה עבור רוב המשפחות גן חלבון באורגניזמים המודל, אם כי כמה גנים מירנה ישנם עדיין אינן ברורות. ערכת בדיקה היינו בעזרת תוכנן בהתבסס על miRBase ⁸ 9, 10, נראה כי miRNAs היונקים הנפוץ ביותר ואת הרלוונטיות ביותר מבחינה ביולוגית כבר מכוסים על ידי קבוצה זו בדיקה.

אין אתגרים טכניים גדולים לבצע ניסויים microarray אישית. בהתבסס על הניסיון שלנו, את המפתחות להצלחת הניסוי microarray הם: 1) להשיג גם מודפס שקופיות, 2) להכין RNA באיכות טובה בכמות מספקת, ו 3) שצריך לשטוף את השקופיות אחרי ההכלאה. מגיב Trizol בדרך כלל התשואות כמויות מספיקות של רנ"א שלם ללימודי הבאים. עם זאת, הביטוי מירנה משתנה בין רקמות שונות שורות תאים. תחת רוב התנאים, 20-25 מיקרוגרם של רנ"א הכל צריך לתת אותות microarray מספיק חזקים כאשר שכותרתו בשיטת קשירת. פחות RNA נדרש דגימות מירנה עשירים כגון אזורים במוח ועל נוירונים. אם רק 1-5 מיקרוגרם של רנ"א הכל פחות או יותר היא שיטה זמינה, תיוג אחריםזה עשוי לשמש, למשל, תיוג של RNA ערכות Invitrogen, והם עולים בקנה אחד עם פלטפורמת microarray אישית המתוארים כאן. עבור השוואות הטובה ביותר, יש תמיד תווית אחת לפחות לשכפל את השליטה על כל דגימות ניסיוני בו זמנית להכליא אותם אצווה להדפיס אותו שקופיות בניסוי יחיד. זה עיצוב המחקר יהיה למזער את תרומתו microarray אותות ההפרש הנובע וריאציות תיוג מדגם עיבוד באיכות שקופיות. ה-DNA הפניה (באדום הערוץ) משמש לשלוט על איכות שקופיות, הכלאה, ואת הכביסה. הכלאה מוצלחת תעניק אותות נקי וחזק בצבע אדום. אם אותות ה-DNA הם טובים אבל אותות RNA הם לא, אז אחד צריך צרות לירות את הצעדים של בידוד RNA וסימון. למשל, האם RNA יש את יחס _260nm / _280nm בין 1.9 לבין 2.1? האם אדמדם גלולה ב 3.3?

עיקר ההשקעותעבור microarrays ניתן להדפסה שקופיות וסריקה. מדפסת microarray ו - סורק מצוידים לעתים קרובות על ידי מתקן הגרעין באוניברסיטאות רבות ובתי ספר לרפואה. Microarrays הדפסת שקופיות lifterslips בתפזורת ושימוש יהיה להקטין באופן משמעותי את העלות. מגלשות שימוש חוזר יש יתרון נוסף של שיפור עקביות של ניסויים microarray ^7. יש לנו שימוש חוזר בשקופיות יותר משש פעמים ומצא את איכות הנתונים עדיין משביע רצון. כדי להבטיח את הרגישות ביותר דגימות או דוגמאות היקר ביותר עם ​​RNAs קלט מינימלי, לעומת זאת, הוא עדיין זהיר להשתמש בשקופיות טרי ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies