执行自定义的微RNA基因芯片实验

Summary

一个简单的程序执行自定义的microRNA微阵列实验描述。这些步骤包括隔离RNA，标签的RNA和参照DNA样本，杂交到芯片，芯片扫描，量化和分析杂交信号。

Abstract

小分子RNA（miRNAs）是一个大家族〜22核苷酸（nt）长的RNA分子，在真核生物^中 1广泛表达。复杂的基因组编码至少有数百个miRNA的，这主要是抑制大量的靶基因的^{转录后2，3}的表达。 miRNA的控制范围广泛的生物过程^1。此外，miRNA表达的改变已经与人类疾病，如癌症，和miRNA可作为生物标志物疾病^{和预后4，} 5。因此，重要的是理解表达和许多不同的条件下miRNA的功能。

已采用文件miRNA表达的实时PCR技术，基因芯片和深度测序的三个主要方法。的miRNA芯片技术具有高通量的优势，一般较便宜，和大多数的实验和分析的步骤可卡尔IED在分子生物学实验室，在大多数大学，医学院校和相关的医院。在这里，我们描述了一个用于执行自定义的miRNA微阵列实验的方法。一个miRNA探针组将印上产生的miRNA微阵列玻片。 RNA是隔离的使用方法或试剂，保留小分子RNA的物种，然后用荧光染料标记。作为对照，参考相应的DNA寡核苷酸的miRNA的一个子集上，也有不同的荧光染料。参照DNA将成为展示的幻灯片和杂交质量，也将用于数据规范化。 RNA和DNA混合并杂交到芯片的幻灯片，其中包含数据库中的大多数miRNA的探针。洗涤后，幻灯片扫描获取图像，个别点强度量化。这些原始信号将得到进一步的处理和相应的miRNA表达数据分析。微安rray幻灯片可以剥离和再生，以降低芯片的成本和提高的微阵列实验的一致性。相同的原则和程序适用于其他类型的定制微阵列实验。

Protocol

1。打印自定义的miRNA芯片

1. 打印芯片的幻灯片，在一所大学或公司使用的芯片的核心设施服务。芯片制造的质量是微阵列实验的成功的最关键因素之一。如果可能的话，尝试一些服务。理想的情况下，人会一次打印50-100幻灯片，和所有的幻灯片看起来相同，具有很好的分离，个别景点，。
2. 对于芯片的支持，我们使用的差距II涂层的幻灯片。
3. 对于miRNA的探针，我们使用NCode多物种的miRNA微阵列探头设置V2的。
4. 溶于3 × SSC在10μM所有的寡核苷酸和异体四上打印的幻灯片。根据GAAPS第二张幻灯片的说明，修复紫外线照射的幻灯片。标签幻灯片用钻石笔，以纪念该地区与印探头方。储存在22 ° C。

2。样品制备

1. 任何方法或试剂可用于分离RNA的，只要它保留了小分子RNA。我们通常使用的Trizol（Invitrogen公司），提取总RNA，令人满意的数量和质量的RNA制剂_作为一个_260nm一 280nm处读数计量，。
2. 对于RNA标记，混合〜25μg总RNA 5' - PCU - DY547 - 3“在1个缓冲区（的50 mM HEPES，pH值7.8，MgCl _2的 20毫米，10微克/ ml的BSA，10％与0.5微克二甲基亚砜）〜20单位T4 RNA连接酶1〜10毫米DTT和〜0.02-0.03终体积为10 × T4 RNA连接酶1对ATP的缓冲补充。
3. 允许标签上冰冰箱为2-24小时内进行。用0.3 M醋酸钠和3体积乙醇沉淀RNA。为了有效地结扎和降水超过200毫克/毫升，溶解总RNA，并保持在20μL总结扎量。
   1. 如果较少的RNA是，输入的核糖核酸（RNA）和5' - PCU - DY547 - 3“可以缩小。/ LI>
   2. 如果RNA是很稀，添加酵母tRNA援助降水等的载体。
4. 合并和标签参考相应的DNA寡核苷酸使用的Alexa Fluor 647核酸标记试剂盒作为杂交过程^控制 6 Ulysis哺乳动物的miRNA的一个子集，共有1微克。 Purify的使用CentriSep列的标记的DNA，并在避光保存在-20 ° C

3。芯片杂交

1. 首次使用幻灯片，预杂交3 × SSC，0.1％SDS，0.2％为30-60分钟BSA，过滤解决方案在幻灯片在37 ° C。淹没在水中几次，然后在异丙醇他们。干幻灯片使用离心分离机，5分钟的幻灯片在100克的适配器，在22 ° C。

注：我们使用康宁芯片杂交商会和伊利Lifterslips科学的mSeries进行芯片杂交。

2. 冲洗李fterslips水，然后在乙醇，在空气中干燥前。放置一个芯片杂交室基地内的幻灯片，对幻灯片的顶部lifterslip。 lifterslip将覆盖探头面积，与联系幻灯片相间。
3. 在黑暗中，自旋向下沉淀，标记的RNA。用70％乙醇洗一次，空气干燥沉淀。颗粒应偏红。
4. 准备杂交溶液中含有400毫米的Na ₂ HPO ₄ pH值7.0，0.8％BSA，5％SDS，12％甲^酰胺 6μL纯化的1/15-1/100，标记的参照DNA（2.4）每RNA样品。添加的引用DNA的数量取决于有多少种不同的寡核苷酸标记（2.4）。如果有超过100个，则需要较少的稀释。
5. 〜60μL杂交液溶解RNA沉淀。
6. 加入20μL的水康宁芯片杂交室基地加湿井。
7. 添加吨他混合物标记的RNA和参照DNA的幻灯片。使用细吸管尖，轻轻触摸lifterslip边缘，允许的解决方案，进入通过吸lifterslip和幻灯片之间的空间。
8. 放置在基地的杂交盒盖，然后密封与金属剪辑室。
9. 把整个塑料袋内室，从康宁室卡带。
10. 将湿纸巾的容器内室的磁带（S），用保鲜膜覆盖容器内放置了37 °彗星潮湿，细胞培养孵化器〜24小时。这些注意事项（3.6，3.9，3.10），确保杂交液不干燥孵化过程中。

4。杂交后处理

1. 逐一拆开室录音带。淹没幻灯片和其lifterslip 2 × SSC在22 ° C。 lifterslip会自然脱落的幻灯片。将其放置在0.8 × SSC。洗在0.8 × SSC幻灯片两次，然后在0.4 × SSC，总在1-2分钟的3倍。干的幻灯片，使用幻灯片适配器离心机。用清水洗净lifterslips和保存后重新使用。
2. 任何合适的扫描仪，如Perkin Elmer公司ScanArray 5000或分子器件的Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描的幻灯片。在波长接近547 nm和647 nm的扫描，以获得相应的的图像文件。
3. 使用BlueFuse，如计划，量化的投入，从4.2图像文件）的像素强度。检查与程序的各个点，以排除进一步审议芯片的异常点。这些异常点通常出现杂交后处理不良的幻灯片打印或幻灯片。
4. 如GeneSpring和Excel进行数据分析和演示方案。总的考虑适用于微阵列数据正常化，这超出了本文的范围。
5. 一旦获得令人满意的信号自动对焦之三4.3），再用⁷地带的芯片幻灯片。在水冲洗的幻灯片，然后在预热，1毫米的NaOH和0.1 × SSC在染色盘，在62 ° C浸泡10-20分钟。重复孵化一次。洗幻灯片22几次水，轻轻摇动60分钟° C.干燥的幻灯片，使用离心机，并存储在22 ° C
6. 要使用可再生的幻灯片，它是没有必要的预杂交再次的。只需由异丙醇水冲洗，干配种前的幻灯片。

5。代表性的成果：

我们基本上遵循所描述的程序来分析全球数千样本的miRNA的表达，即在许多不同的条件下，从斑马鱼中分离人体标本的RNA。图1显示了一个非常精确和较强的杂交信号，证明对微阵列扫描图像幻灯片。皮尔逊correlati系数之间的技术复制芯片杂交〜0.99 ^7，说明优秀的重复性。

图1合成图像扫描的miRNA杂交后的芯片幻灯片。而黄色斑点相同的探针的DNA和RNA的杂交，导致杂交参考DNA，DY547 -标记的RNA样品的绿色斑点，红色斑点。

Discussion

尽管深度测序技术的最新进展，芯片仍然是一个可行的选择，为高通量DNA和RNA分析。深度测序相比，微阵列实验比较便宜，一个典型的分子生物学实验室可以执行大部分的实验和数据分析的房子，允许灵活性和节省时间。在未来的芯片可能非常适合集中审问的基因，例如集，全部或在基因组或miRNA的转录因子的一个子集，这里提出相同的原则和程序可以用于定制微阵列实验研究此外miRNA的基因家族。当然，关于芯片的主要缺点是序列信息，必须提供一个先验。这不是一个问题，大部分的模式生物的蛋白质基因家族，虽然有多少miRNA基因仍不清楚。我们一直使用的探针组的目的是基于miRBase ⁸ 9，10，这是明显的，最丰富和最生物学相关的哺乳动物的miRNA已经通过这个探头设置。

有没有重大的技术挑战，以执行自定义的微阵列实验。根据我们的经验，微阵列实验的成功的关键是：1）获得印制的幻灯片，2）RNA质量好，并准备足够数量，以及3）正确洗杂交后的幻灯片。 Trizol试剂通常产生足够数量的后续研究完整的RNA。然而，不同组织和细胞系的miRNA表达变化。 20-25μg总RNA在大多数情况下，应给予足够强大的芯片信号时结扎方法标记。减RNA是必需的miRNA的丰富样品的大脑区域和神经元等。如果只有1-5微克或更少的总RNA，其他标记方法s可能会使用，例如，RNA标记来自Invitrogen公司的试剂盒，以及它们与这里描述的定制芯片平台兼容。最好的比较，应始终所有的控制和实验样品的标签至少有一个复制，同时，他们在一次实验中相同的幻灯片打印一批杂交。本研究设计将最大限度地减少差芯片样品的标签和处理，并在幻灯片质量的变化产生的信号的贡献。参照DNA（红色通道）作为一个幻灯片，杂交和洗涤质量的控制。一个成功的杂交会给红色的清洁和强烈的信号。如果DNA的信号是好的，但没有RNA信号，那么应该麻烦拍RNA分离和标签的步骤。例如，RNA的比例为1.9和2.1之间的一个_/一个为 280nm 260nm？ 3.3颗粒红？

大部分的投资微阵列可打印和扫描幻灯片。一个芯片的打印机和扫描仪往往是装备在许多大学和医学院的核心设施。在印刷批量和重复使用幻灯片和lifterslips芯片将显着地降低了成本。重用幻灯片，有额外的优势，改善微阵列^实验 7的一致性。我们已经重用幻灯片的6倍以上，并发现数据的质量还是令人满意的。要确保用最小的投入的RNA的灵敏度最好最珍贵的样品或样品，但是，它仍然是审慎的做法是用^新鲜的幻灯片7。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies