Summary
यहाँ हम एक मानव LentiPlex जमा पुस्तकालय और पारंपरिक तरीकों अनुक्रमण जीन सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लक्ष्यों की पहचान का उपयोग करें. हम दिखाना है कैसे स्थापित करने और एक LentiPlex स्क्रीन deconvolute और परिणाम को मान्य.
Abstract
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) जीन अभिव्यक्ति के नियमन के लिए एक आंतरिक सेलुलर तंत्र है. दोहन इस प्रणाली के जन्मजात शक्ति जीन समारोह के अध्ययन के नुकसान में पछाड़ना जीन अभिव्यक्ति के स्तर के लिए हमें सक्षम बनाता है.
आरएनएआई प्रदर्शन के लिए दो मुख्य तरीके हैं. पहले छोटे हस्तक्षेप (siRNAs) RNAs कि रासायनिक संश्लेषित कर रहे हैं का उपयोग है, और दूसरा इस्तेमाल कम बाल के लिये कांटा (shRNAs) RNAs 1 plasmids के भीतर इनकोडिंग. बाद कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है है सीधे या प्रतिकृति अक्षम lentiviral कणों में पैक. lentiviral shRNAs का उपयोग करने का मुख्य लाभ सेल प्रकार, उनके stably दीर्घकालिक जीन मारकर गिरा दिया और चयन के लिए जीनोम में एकीकृत करने की क्षमता है, और उच्च throughput समारोह स्क्रीन के नुकसान के संचालन में उनकी प्रभावकारिता की एक विस्तृत विविधता में शुरूआत में आसानी है. इस सुविधा के लिए हम shRNA पुस्तकालय LentiPlex जमा बनाया है.
एमआईएसएसआईओएन LentiPlex मानव shRNA जमा लाइब्रेरी एक जीनोम चौड़ा lentiviral उत्पादन पूल एक मालिकाना प्रक्रिया का उपयोग है. पुस्तकालय shRNA constructs ७५००० अधिक टीआरसी संग्रह से 15,000 लक्ष्यीकरण + मानव जीन 2 के होते हैं . प्रत्येक लायब्रेरी shRNA प्रतिनिधित्व के लिए उत्पाद रिलीज से पहले परीक्षण किया है मजबूत पुस्तकालय कवरेज सुनिश्चित करने के लिए. पुस्तकालय में कम से कम 5 x 10 8 p24 परख के माध्यम से टीयू / एमएल के titers में एक प्रारूप तैयार करने के लिए उपयोग lentiviral प्रदान की जाती है और पूर्व विभाजित लगभग 8000 shRNA के दस subpools में प्रत्येक constructs. प्रवर्धन और अनुक्रमण प्राइमरों भी बहाव के लक्ष्य की पहचान के लिए प्रदान की जाती हैं.
पिछले अध्ययनों TRAIL की एक synergistic अर्बुदरोधी गतिविधि की स्थापना जब A549 कोशिकाओं, एक मानव फेफड़ों कार्सिनोमा सेल पंक्ति 3, 4 में Paclitaxel के साथ संयुक्त . इस अध्ययन में हम एक LentiPlex जमा shRNA पुस्तकालय के आवेदन तेजी से cytotoxicity ओ में शामिल जीनों के लिए एक सकारात्मक चयन स्क्रीन का संचालन करने के लिए दिखाना हैच A549 कोशिकाओं है जब TRAIL और Paclitaxel से अवगत कराया. एक उच्च throughput स्क्रीन के साथ अक्सर सामना करना पड़ा बाधा लागत और deconvolution में कठिनाई है, हम भी एक लागत प्रभावी पॉलीक्लोनल पारंपरिक अनुक्रमण उपयोग दृष्टिकोण विस्तार.
Protocol
LentiPlex जमा स्क्रीन सेटअप
ब्याज की shRNA दृश्यों की पहचान करने के लिए, यह ऐसी है कि कोशिकाओं के बहुमत प्राप्त केवल एक shRNA निर्माण स्क्रीन स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक MOI कम (संक्रमण की बहुलता) का उपयोग करके, सेल प्रति एकाधिक integrants की संभावना काफी कमी आई है. हालांकि, पारगमन क्षमता, और इसलिए वांछित MOIs, लक्ष्य कक्ष प्रकार पर दृढ़ता से निर्भर है. इसलिए, यह जरूरी है कि इष्टतम MOI का निर्धारण एक नया सेल प्रकार में स्क्रीन शुरू करने से पहले बाहर किया जाता है.
1. मिशन LentiPlex के साथ लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन shRNA पुस्तकालय जमा
- MOI वास्तविक इस्तेमाल किया विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए अलग अलग होंगे. यदि प्रतिकृति रहे हैं वांछित तो प्लेटों की संख्या के हिसाब से वृद्धि की जानी चाहिए. इसके अलावा, आमतौर पर यह अलग subpools गठबंधन करने के लिए लाभप्रद नहीं किया जाएगा. Subpools अलग रखते हुए deconvolution प्रक्रिया में सहायता करेगा. Prope सुनिश्चित करेंr subpool संख्या है कि पारगमन के दौरान लागू किया जाता है के साथ प्रत्येक ऊतक संस्कृति पकवान की लेबलिंग. एक MOI कम सेल प्रति एकाधिक integrants की संभावना को कम करने की सलाह दी है.
- दिन 1 - बीज पर्याप्त अगले दिन (कुल 10 पूल, प्रत्येक कुल = 30 व्यंजन तीन प्रतियों में प्रदर्शन) पर ~ 70% confluency प्राप्त कोशिकाओं के साथ 60 मिमी व्यंजन की उपयुक्त संख्या. हमारे अध्ययन के लिए, 60 मिमी व्यंजन x 6 105 A549 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त थे करने के लिए 70% की एक confluency प्राप्त करने के पारगमन के लिए पहले. यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं घातीय वृद्धि चरण में अभी भी. विकास दर सेल प्रकार के आधार पर भिन्न है और स्क्रीन शुरू करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए.
- कोशिकाओं 37 पर रातोंरात incubating ° humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के माहौल में सी द्वारा पालन करने की अनुमति दें.
- (वैकल्पिक) नकारात्मक नियंत्रण shRNAs के साथ पारगमन के लिए दो अतिरिक्त 60 मिमी व्यंजन शामिल करें. व्यंजन लेबल "नियंत्रण" SHC001H और "नियंत्रण बी" SHC002H के लिए के लिए.
- दिन 2 - transduce वेंLentiPlex वायरल कणों के साथ ई की कोशिकाओं. पारगमन के दिन पर, बर्फ पर lentiviral कणों पिघलना.
- एक लामिना का प्रवाह हुड के लिए thawed कणों स्थानांतरण और बर्फ पर रखने के लिए अगर नहीं इस्तेमाल किया जा रहा है तुरंत.
- परिकलित कितना प्रत्येक व्यक्ति वायरल कोशिकाओं को जोड़ने के 1 के सभी सेल संस्कृति व्यंजन भर MOI मिल के उप - पूल के.
- उदाहरण: 1 x 6 10 कोशिकाओं / पकवान, वायरल अनुमापांक = 5 x 10 8 / TU मिलीलीटर, 1 के एक वांछित MOI. i. 1) x 10 6 कोशिकाओं / एक्स पकवान (1 की MOI) = 1 x 10 6 transducing (टीयू) इकाइयों की जरूरत ii. 1) 10 x TU / 6 (5.0 x 10 8 / TU मिलीलीटर) के सी से प्राप्त lentiviral स्टॉक समाधान की एक = 2 μL उपयुक्त पकवान जोड़ा जाना चाहिए. पूरा मीडिया के 100-300 μL में वायरस की गणना राशि पतला क्रम में वायरस के बेहतर वितरण जब सेल संस्कृति डिश को जोड़ा सुनिश्चित है.
- पूर्व वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से मीडिया निकालें. पूरा मीडिया conta जोड़ेंining hexadimethrine ब्रोमाइड प्रत्येक पकवान समाधान. मीडिया में hexadimethrine ब्रोमाइड की सिफारिश की अंतिम एकाग्रता 8 μg / मिलीलीटर है. कम hexadimethrine ब्रोमाइड का प्रयोग करें अगर आप इसे अपने लक्ष्य की कोशिकाओं को विषाक्त हो पाते हैं.
- पूर्व निर्धारित प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार उचित बर्तन को shRNA lentiviral कणों जोड़ें. धीरे ज़ुल्फ़ प्लेटें समान रूप से कोशिकाओं भर के लिए वायरस वितरित.
- 37 पर 18-20 घंटे सेते ° 5% सीओ 2 के माहौल में एक humidified इनक्यूबेटर में सी.
- (वैकल्पिक) SHC001H साथ MOI के समान (खाली वेक्टर shRNA नियंत्रण) नियंत्रण डिश में एक और नियंत्रण डिश बी में SHC002H shRNA नियंत्रण तले इन व्यंजनों प्रयोग भर प्रयोगात्मक व्यंजन में समान समझो 3-8 दोहराएँ.
- दिन 3 - मीडिया बदलें. वायरस युक्त मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और ताजा पूरा मीडिया (hexadimethrine ब्रोमाइड के बिना) जोड़ने. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं.
2. मढ़वाया समझोचिकित्सकीय घटक / अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं
- दिन 4 - कुओं से महाप्राण (व्यंजन) मीडिया और ताजा इष्टतम एकाग्रता में चिकित्सीय घटक युक्त मीडिया जोड़ें. संस्कृति शर्तों के साथ के रूप में, उपचार भिन्न है और उचित सांद्रता और durations के पहले से निर्धारित किया जाना चाहिए. हमारे अध्ययन में, हम 100 एनजी / TRAIL और Paclitaxel के एक सुक्ष्ममापी के एमएल इस्तेमाल किया. कक्ष 48 घंटे के लिए इलाज किया गया.
- T75 बोतल में जीवित कोशिकाओं होना चाहिए फिर से वरीयता प्राप्त और लगभग 100% सहधारा तक विस्तार करने की अनुमति दी.
- (वैकल्पिक) चयन के अंत में, एक और नियंत्रण डिश बी डिश एक और डिश बी प्रत्येक जमा पुस्तकालय व्यंजनों की कम से कम एक से कम कालोनियों होना चाहिए डिश नियंत्रण निरीक्षण. यदि वहाँ एक डिश में कालोनियों की संख्या अप्रत्याशित रूप से उच्च रहे हैं, या तो पारगमन प्रक्रिया वांछित phenotype या चयनात्मक दबाव से संबंधित मार्ग को प्रभावित किया है की तुलना में पर्याप्त रूप से मजबूत और परख के फिर अनुकूलन नहीं है आवश्यक हो सकता है. यदि डिश बी भी कई कालोनियों शामिल, तो shRNA और आरएनएआई मार्ग की सगाई की अभिव्यक्ति ब्याज की phenotype पर एक प्रभाव हो सकता है. यदि यह SHC001H के साथ मामला दोहराने के लिए, करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रभाव SHC002H के लिए विशिष्ट नहीं है.
3. एक पॉलीक्लोनल सेल की आबादी से deconvolution
- प्रत्येक subpool से कोशिकाओं की विषम जनसंख्या हार्वेस्ट और जीनोमिक डीएनए अलग. हमारे परीक्षण में, कोशिकाओं को संक्षेप में पीबीएस में धोया गया और trypsinized पहले जीनोमिक डीएनए GenElute स्तनधारी जीनोमिक Miniprep किट और आपूर्ति प्रोटोकॉल (सिग्मा Aldrich, G1N70) का उपयोग कर पृथक किया गया. वैकल्पिक रूप से, किसी भी अन्य जीनोमिक शुद्धि किट है कि वर्तमान में बाजार पर उपलब्ध हैं डीएनए अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं के प्रारंभिक राशि के लिए प्रोटोकॉल की सिफारिशों का पालन करें.
- लक्ष्य का पीसीआर प्रवर्धन. shRNA टेम्पलेट वसूली प्रक्रिया चयनित सेल की आबादी से shRNA आवेषण के पूरे पूल का प्रवर्धन या indivi की पुनर्प्राप्ति सक्षम बनाता हैकालोनियों से दोहरी shRNA टेम्पलेट्स है कि व्यक्तिगत रूप से और उठाया गया था और विस्तार. नियंत्रण और चयनित लक्ष्य कोशिकाओं से shRNA आवेषण के प्रवर्धन के बाद, पीसीआर उत्पादों अनुक्रम किया जा सकता है.
- यह पीसीआर प्रवर्धन कदम सिग्मा Readymix, कैटलॉग सं P2893 का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था. अन्य अभिकर्मकों प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन साइकिल चालन शर्तों और / या मैग्नीशियम एकाग्रता सफल प्रवर्धन के लिए संशोधित किया जा आवश्यकता हो सकती है. एकाग्रता 20 मिमी पर प्रवर्धन प्राइमरों LentiPlex किट के साथ शामिल हैं.
- पीसीआर प्रतिक्रिया तालिका 1 में वर्णित के रूप में सेट करें. सूचीबद्ध क्रम में घटक जोड़ें. वर्णित मात्रा में एक 50 μL प्रतिक्रिया के लिए कर रहे हैं. अधिक प्रतिक्रियाओं के लिए, प्रतिक्रियाओं की वांछित संख्या से मास्टर मिश्रण घटकों पैमाने पर और 10% अधिक बढ़ा हुआ शामिल हैं. डीएनए टेम्पलेट की राशि की सिफारिश की 50-100 एनजी है.
- यह पुरजोर सिफारिश की है कि एक प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट मिशन shRNA मानव सकारात्मक नियंत्रण appropr को पतला वेक्टर के होते हैंएकाग्रता देर हो गई. इस टेम्पलेट के साथ सफल प्रवर्धन यह इंगित करता है कि पीसीआर परख घटकों और साइकिल चालन की स्थिति के लिए पर्याप्त हैं. नोट: प्रयोगात्मक नमूने और अभिकर्मकों के carryover प्रदूषण को रोकने के के लिए, यह सुझाव दिया है कि सकारात्मक नियंत्रण जहां बाद पीसीआर प्रतिक्रियाओं स्थापित कर रहे हैं से एक अलग स्थान में पतला हो.
- पीसीआर अपने thermocycler में तालिका 2 में सूचीबद्ध कार्यक्रम सहेजें.
- प्रत्येक नमूना के लिए, 3 DirectLoad के 5 μL बगल में डाई और electrophorese 1 μL के साथ μL पीसीआर प्रतिक्रिया पीसीआर ™ 100 बीपी कम सीढ़ी, कैटलॉग D3687 संख्या एक 1% agarose जेल पर 309 बीपी amplicon की उपस्थिति की पुष्टि करने गठबंधन.
- पीसीआर amplicons Subcloning: पीसीआर उत्पादों थे Topo क्लोनिंग Topo - प्रादेशिक सेना किट का उपयोग कर, निर्माता प्रोटोकॉल के बाद (Invitrogen, K4575-01) क्लोन. नतीजा यह है कि एक पीसीआर उत्पाद प्रत्येक सदिश में निहित है.
- 250 व्यक्तिगत बैक्टीरियल कालोनियों (प्रत्येक एक व्यक्ति पीसीआर amplicon युक्त) अलग थे और बढ़नेn 2 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ लेग के एमएल संस्कृतियों में. प्लास्मिड डीएनए तो GenElute प्लाज्मिड Miniprep किट (सिग्मा Aldrich, PLN70) का उपयोग कर निकाला गया था.
- प्लास्मिड डीएनए शुद्ध EcoRI के साथ पचा किया गया था और डालने की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए electrophoresed.
- प्लास्मिड डीएनए के नमूने और फिर अनुक्रम थे shRNA डालने LentiPlex shRNA अनुक्रम खोज LentiPlex पुस्तकालय के साथ प्रदान डेटाबेस का उपयोग पहचान की.
4. लक्ष्य पहचान और मान्यता
- shRNA अनुक्रम 5'-GAAACACCGG-3 के साथ शुरू की है. कम से कम 10 अगले लेकिन संलग्न shRNA अनुक्रम खोज Access डेटाबेस फार्म पर खोज बॉक्स में क्वेरी अनुक्रम के रूप में कम से कम 21 nucleotides दर्ज करें.
- जमा shRNA की प्रजातियों का चयन करें. वैकल्पिक रूप से, जिसमें से अनुक्रम पाया गया subpool का चयन करें.
- अब "संभावित हिट्स खोजें" बटन खोज प्रदर्शन करने के लिए पर क्लिक करें. यह इसी टीआरसी shRNA (ओं) अनुक्रम कि वें मैच की पहचान करनी चाहिएई डेटा अनुक्रमण. टीआरसी shRNA अनुक्रम पर अधिक जानकारी (ओं) की पहचान है और इसी जीन लक्ष्य आसानी से सिग्मा Aldrich आपका पसंदीदा जीन में पाया जा सकता है है: http://www.sigma.com/yfg
- पहचाने गए लक्ष्य जीन मूल टीआरसी क्लोन से अधिक कम से कम दो अतिरिक्त shRNAs कि एक ही प्रारूप करने के लिए एक अच्छी तरह से एक एक shRNA उपयोग कर जीन लक्ष्य के साथ मूल स्क्रीनिंग परख दोहरा द्वारा मान्य किया जाना चाहिए. यह सच है हिट कुओं के बहुमत में वही phenotype प्रदर्शित करेगा.
5. प्रतिनिधि परिणाम
एक LentiPlex जमा स्क्रीन वर्कफ़्लो का एक उदाहरण चित्र 1 में विस्तृत है. Transduced कोशिकाओं है कि TRAIL और Paclitaxel की उपस्थिति में proliferated के विस्तार जब तक बोतल सहधारा थे की अनुमति दी गई. जीनोमिक डीएनए काटा था और पीसीआर प्रवर्धन और क्लोनिंग के अधीन के रूप में चित्र 1 में सचित्र, अनुक्रमण और shRNA पहचान के लिए प्रस्तुत किया जा रहा से पहले के रूप में figu में वर्णितफिर से एक 250 क्लोन सी., 25 इन के अनुक्रम कई क्लोन द्वारा प्रतिनिधित्व थे और शेष 225 केवल एक क्लोन द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे थे और इस समय का पीछा नहीं थे.
चित्रा 2 में दिखाया गया है, TBX3, PPP2CA, और AKT2 सहित कई उम्मीदवार जीन कई क्लोन द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे थे. प्रतिलेखन टी बॉक्स कारक, TBX3 चार क्लोन के कुल में दिखाई दिया है और ट्यूमर प्रवास 5 में फंसाया गया है . PPP2CA downregulation एण्ड्रोजन अभाव प्रेरित सेल चक्र गिरफ्तारी से राहत और 6 apoptosis को रोकने के द्वारा LNCaP एण्ड्रोजन कमी की स्थिति में संवर्धित कोशिकाओं के विकास को बनाए रखने के लिए प्रदर्शित किया गया है. AKT2 आरएसी बीटा सेरीन / threonine प्रोटीन kinase और ख्यात ओंकोजीन कैंसर विकास 7, 8 में कई भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन है.
* 2 मिलीग्राम के अंतिम एकाग्रता समाधान + 3 मिमी हो जाएगा;1.5 मिमी Taq Readymix और मैग्नेशियम क्लोराइड समाधान से 1.5 मिमी से योगदान है.
तालिका 1. Lentiplex पीसीआर रिएक्शन स्थितियां
टेबल 2 Lentiplex पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम
चित्रा 1. (ए) LentiPlex स्क्रीन जमा, (बी) पॉलीक्लोनल deconvolution वर्कफ़्लो, और (सी) shRNA लक्ष्यों की पहचान.
ए LentiPlex स्क्रीन जमा सबसे पहले, बीज कोशिकाओं, फिर shRNA subpools जोड़ने के लिए, (कुल 10 पूल, प्रत्येक तीन प्रतियों में प्रदर्शन, 30 कुल व्यंजनों के लिए). . अगला, चिकित्सकीय घटक / अभिकर्मक (हमारे मामले में, TRAIL और पा के साथ इलाजclitaxel, क्रमशः). फिर बोतल में जीवित कोशिकाओं Reseed और विस्तार करने के अनुमति देते हैं. हार्वेस्ट प्रत्येक subpool से कोशिकाओं की विषम जनसंख्या और जीनोमिक डीएनए अलग.
बी पॉलीक्लोनल deconvolution. पीसीआर प्रदर्शन shRNA डालने युक्त डीएनए बढ़ाना. पीसीआर उत्पाद आकार में एक समान है, लेकिन पॉलीक्लोनल अनुक्रम में है टेम्पलेट gDNA के बाद से भी पॉलीक्लोनल था. पीसीआर उत्पाद वेक्टर में क्लोन है और फिर सक्षम बैक्टीरिया में तब्दील है.
ShRNA लक्ष्यों की पहचान सी. व्यक्तिगत कालोनियों अलग और प्लास्मिड डीएनए निकाला जाता है. प्रत्येक क्लोन एक व्यक्ति पीसीआर टुकड़ा के साथ क्लोनिंग वेक्टर शामिल हैं. प्लास्मिड डीएनए डालने और अनुक्रम की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पचता है. shRNA डालने LentiPlex shRNA अनुक्रम खोज डेटाबेस का उपयोग करने के लिए पहचाना जाता है.
चित्रा 2. पहचान कर सकते हैंdidate जीन 25 उम्मीदवार जीन की पहचान की गई है कि कई हिट था . 225 उम्मीदवार जीन केवल 1 हिट था और पीछा नहीं थे. उम्मीदवार जीन प्रति व्यक्ति क्लोनों की एक टूटने के लिए पूरक तालिका 1 देखें.
पूरक तालिका 1. व्यक्तिगत टीआरसी पुस्तकालय पॉलीक्लोनल अनुक्रमण जीन आईडी से पहचाना क्लोन का पता लगाया गया क्लोन हिट्स.
Discussion
इस अध्ययन में, हम एक जीनोम चौड़ा स्क्रीन / Paclitaxel के TRAIL उपचार के बाद A549 कोशिकाओं के cytotoxicity में शामिल जीन की पहचान उपस्थित थे. एक जीनोम चौड़ा स्क्रीन में जमा दृष्टिकोण का उपयोग समय, लागत, और उपकरण निवेश आम तौर पर पारंपरिक arrayed स्क्रीन के साथ जुड़े कम कर देता है. स्क्रीन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण पहले से प्रदर्शन अनुकूलन प्रयोगों हैं. Transduction शर्तों और MOI empirically निर्धारित किया जाना चाहिए.
चयन विधि वांछित phenotype (जैसे, अस्तित्व, सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति, आदि) प्रदर्शित कोशिकाओं की मजबूत चयन के लिए अनुमति चाहिए. इन मानकों के अनुकूलन झूठी सकारात्मक का पता लगाया संख्या कम हो जाएगा.
यहाँ, gDNA चयनित कक्षों के थोक आबादी से काटा गया था और तब Topo व्यक्तिगत shRNA आवेषण पहचान क्लोन. इस प्रयोग के लिए संभव सुधार रहते FACS का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित कोशिकाओं के लिए चयन किया गया हैकि केवल जीवित कोशिकाओं को एकत्र कर रहे हैं. लक्ष्यों की पहचान एक स्क्रीनिंग परख में लक्ष्य विशिष्ट shRNAs के साथ पारगमन से मान्य होगा. यह सच है हिट कुओं के बहुमत में phenotype प्रदर्शित करेगा.
LentiPlex जमा लाइब्रेरी अपने आवेदन में लचीला है. यह बहाव के अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी के साथ संगत है और या तो सकारात्मक या नकारात्मक चयन रणनीतियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. स्क्रीनिंग की स्थिति पर निर्भर करता है, shRNA आवेषण के deconvolution पीसीआर / क्लोनिंग, माइक्रोएरे, या अगली पीढ़ी 9 अनुक्रमण, 10 के माध्यम से पूरा किया है जबकि शक्ति और इन तकनीकों की गति आरएनएआई स्क्रीन deconvolute अच्छी तरह से स्थापित है, माइक्रोएरे के साथ एक चिंता का विषय है और. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तरीकों जैव सूचना विज्ञान संसाधनों और ज्ञान को सही ढंग से विश्लेषण और प्रायोगिक परिणामों की व्याख्या की जरूरत है की उपलब्धता है. इन तकनीकों के साथ जुड़े लागत अक्सर बार जीनोम चौड़ा स्क्रीन के उपक्रम के लिए एक बाधा हो सकते हैं. एपी/ सीआर क्लोनिंग आधारित दृष्टिकोण है, जबकि प्रोटीन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में के रूप में शक्तिशाली नहीं है एक प्रभावी और कम लागत वैकल्पिक है.
Agilent अब एक कस्टम टीआरसी shRNA LentiPlex स्क्रीन में आगे सहायता के लिए पुस्तकालय के आधार पर सरणी प्रदान करता है. इन विकल्पों के शोधकर्ताओं LentiPlex का उपयोग करने के लिए सेलुलर कार्यों की एक विविध रेंज का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं.
Disclosures
मैथ्यू जे Coussens, कोर्टनी Corman, एशले एल फिशर, जैक साबूदाना, और जॉन Swarthout सिग्मा Aldrich, जो इस लेख में इस्तेमाल किया उपकरणों और अभिकर्मकों बनाता द्वारा नियोजित कर रहे हैं.
Acknowledgments
मिशन सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. के एक पंजीकृत ट्रेडमार्क है
LentiPlex सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. का एक टे्रडमार्क है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LentiPlex Pooled Array |  Sigma-Aldrich |
SHPH01 | |
| A549 Cells | ATCC | CCL-185 | |
| TRAIL | Sigma-Aldrich |
T5694 | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich |
T7402 | |
| Topo TA Cloning Kit | Invitrogen | K4575-01 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich |
P2893 | |
| GenElute Plasmid Miniprep kit | Sigma-Aldrich |
PLN70 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich |
H9268 |
References
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