Summary
描述一个分析，定量分析转化生长因子（TGF）-β诱导的三维胶原凝胶侵袭。这个实验需要的细胞株MCF10A系列，代表不同阶段乳腺癌的发展优势。通过这种方法可以用于其他细胞系，并可能被用来调查其他潜在的激活或入侵抑制剂。
Abstract
TGF -β有反对乳腺癌进展中的角色，作为一个在初始阶段的抑癌， 但在稍后阶段1,2刺激的侵袭和转移。此外，TGF -β是经常过度表达在乳腺癌中，其表达与预后差， 转移 3,4有关。其中TGF -β诱导的入侵是不能很好地理解的机制。
TGF -β诱发细胞通过TGF -β型II（TβRII）和I型（TβRI）受体反应。当TGF -β诱导的异聚复合物的形成，TβRII磷酸化TβRI。激活TβRI启动Smads的磷酸化受体（R - Smads的），即Smad2的和Smad3的细胞内的规范信号转导通路。这些活化的R - Smads的形式与Smad4的异聚复合物，积聚在细胞核内调节靶基因的转录 5 。除了以前ð旁切Smad通路，在其他几个非Smad信号通路的激活受体激活的结果，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径6。
要研究的TGF -β在乳腺癌的不同阶段中的作用，我们使用的MCF10A电池系统。该系统由自发永生MCF10A1供应量（M1）乳房上皮细胞的H - RAS转化M1衍生MCF10AneoT供应量（M2），在小鼠8癌前病变，生产和M2衍生MCF10CA1a（M4），成立M2的异种移植和形式与能力转移到肺9高年级癌。这MCF10A系列提供了可能性，研究与恶性肿瘤的不同等级是由不同的遗传背景不偏颇细胞的反应。
对于TGF -β诱导的入侵的分析，我们产生的同型MCF10A球体细胞培养EMBEdded在三维胶原基质在体外 （图1）。这种模型非常类似于人类肿瘤在体内建立一个氧气和营养物质的梯度， 造成 10球体内部的外部和静态的，甚至坏死细胞活跃，侵入细胞。球体为基础的检测也已证明，以更好地复述比单层培养 11的耐药性。这MCF10三维模型系统允许我们调查的乳腺细胞的侵入特性，在不同阶段的恶性肿瘤的TGF -β信号的影响。
Protocol
1。 METHOCEL解决方案的准备（500毫升）
- 高压灭菌6克甲基纤维素在500毫升瓶含有磁力搅拌器。
- 甲基为20分钟，在250毫升预热的DMEM/F12无血清（60℃）溶解。
- 加入250毫升的DMEM/F12含10％马血清（RT）的。混合过夜（4℃）。
- 清除离心（5000G，2H，4℃）的解决方案。
- 以明确的高粘度的解决方案到一个新的管（约90-95％的原液）。
- 储存在4℃，直到使用C。
2。球体文化
- 准备了20％METHOCEL溶液（10毫升METHOCEL和40毫升的生长介质）。
- 用PBS洗涤细胞两次，加入0.1％胰蛋白酶孵育细胞在37 ° C
- 重悬细胞生长介质和细胞计数。
- 准备暂停10 000个细胞每毫升20％METHOCEL。
- 细胞悬液加入96孔圆底小号uspension板（每孔100μL）。
- 第二天，检查中悬浮板的球体形成。球体将后1-3天即可使用。
3。胶原蛋白的制备
- 在冰上，准备8毫升的胶原蛋白，10X PBS 1毫升，1毫升0.1 N的氢氧化钠和3滴0.1 N的盐酸溶液。检查如果pH值是7.4 pH指示剂条通过发现一些解决方案。如果超出范围，调整pH值。
- 添加瓦解胶原溶液50μL，在96孔板井
- 在37 ° C直到胶原蛋白是凝固（90分钟）。
- 准备上冰METHOCEL胶原蛋白配体的解决方案：每个配吸管1胶原蛋白溶液的一部分。新增20纳克每毫升含胶原蛋白转化生长因子-β。 METHOCEL和对不同层次的扩散稀释后，最终的TGF -β浓度将于5毫微克/毫升涡旋混合。加入1 METHOCEL解决方案的一部分。混合振荡。
4。球体嵌入丁
- 将200μl的针尖对针尖切断约5毫米，200μL移液器。吸用移液管的一个球体，并仔细免除到一个空板的介质。观看球体里面的提示保持。球体是一个白点可见。不释放活塞，吸100μL胶原METHOCEL混合和分配到胶原蛋白涂层96的胶原蛋白的混合物球体。 12每个条件的球体。
- 胶原巩固至少30分钟，在37 ° C
- 取出200μL提示气泡。
- 添加50μL培养基，血清和1.6％DMSO溶解抑制剂。 SB - 431542添加4μL原液（10毫米），以1毫升中等。抑制剂终浓度扩散后，将于10微米。 TGF -β和抑制剂将停留在实验的过程中。使用40X放大倍率的显微镜下的球体的图片。
- 经过48H与TGF -β和/或抑制剂刺激，使用40X放大倍率的显微镜下的球体的图片。
- 测量术后第2天入侵球体的面积和减去起步区。测量的面积，球体：打开图片在Adobe Photoshop Extended中（图2A）的球体，选择快速选择工具（图2b）。成圆形鼠标指针变为一个“加”号（+）（图2c）。球体的同时拖动光标，Photoshop将承认球体的边界。如果被选中球体以外的领域，这个区域可以被排除在外的选择，按Alt键或通过阴性选择的工具，这是由一个表示（ - ）在工具栏上签署。 （ - ）成圈与“减”的光标改变符号和错误选定区域拖动光标，这一方面是从选择（图2d）。如果有必要，多个区域，可以选择按了SHIFT按钮。为了更准确地工作，鼠标指针的大小可以调整，通过改变工具栏上的画笔直径（图2E）。当整个球体被选中，选择面积计算，通过菜单栏中的的分析测量，或按CTRL + SHIFT + M（图2F）。测量记录“窗口中显示的文件名和以像素为单位的选择方面，以及其他数据（图2G）。如果选择多个测量，第一行显示所有地区的总和。个人选择的测量是在下面的线条。所有的测量数据可以导出到一个文本文件，并在Excel中打开。
5。代表性的成果：
MCF10A1供应量（M1）正常乳腺上皮细胞的球体检测的一个例子，H - RAS转化MCF10AneoT供应量（M2）细胞和M2衍生MCF10CA1a（M4）是在图3中给出。 M1细胞表明，只有疲软的入侵无刺激，但显著入侵后，由TGF -β刺激。相比之下，在RAS转化的货币供应量M1衍生M2的入侵已经没有刺激除了高效，这是进一步提高TGF -β治疗后的4-5倍。 M4的细胞表现出最强的入侵，与TGF -β此外。
下一步，我们检查我们是否可以在这个球体模型使用化学抑制剂与TGF -β-诱导的入侵干扰。为此，我们使用了SB - 431542，ATP模拟和TβRI激酶活性的选择性抑制剂，以及Ib型受体激活素（ActRIB）和激活素样受体激酶（ALK）7月12日。正如所料，SB - 431542有效抑制TGF -β诱导的入侵货币供应量M1，M2和M4的细胞（图4），表明TGF -β诱导的入侵是TβRI激酶依赖。此外，基底入侵的球体也强烈抑制，表明基底入侵也是德对转化生长因子-β下垂。
图1。3D球体检测流程图。首先，细胞非贴壁条件下在U形悬浮板镀金。细胞aggregrate multcellular球体和可嵌入成胶原基质。进入这个胶原基质，它们能侵入。
图2：使用Adobe Photoshop的球体面积的量化扩展。 （一）球体的图片打开ADOBE PHOTOSHOP Extendend（二）选择“快速选择”工具拖动球体光标选择球体（四）去除一个wongly包括使用面积面积（三）负面的快速选择工具（E）快速选择工具的笔刷大小的调整，以便更准确地选择面积（F）的选择测量命令记录（G）的测量记录的例子。
图3。TGF -β诱导自发永生MCF10A1供应量（M1）（一）球体的侵袭，RAS转化MCF10AneoT供应量（M2（B）和转移性衍生MCF10CA1a（M4）（C）货币供应量M1，M2和M4的球状体嵌入胶原5ng/ml的TGF -β处理48h后表示，AC代表图片嵌入一天，两天后，D相对入侵第2天减0天的区域差异的量化结果表示以平均值± SD 13日改编。
图4。基底和TGF -β诱导的球体入侵抑制bŸ SB - 431542。货币供应量M1，M2和M4的球状体嵌入到胶原蛋白和5ng/ml TGF -β和/或10微米的SB - 431542作为治疗。术后第2天（一）采取的代表图片。第2天减第0天（二）面积差异，相对的入侵进行了量化。结果表示为平均值± SD 13日改编。
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Discussion
我们建立了一个球体的模型，其中MCF10A1细胞和其恶性衍生物成胶原基质中的TGF -β-依赖性入侵。首先，球体形成96井圆底暂停存在甲基板。当然，也U形聚甲基丙烯酸羟乙酯涂层板，可用于这一目的。甲基纤维素是绝对必要的，在这一步，，因为细胞就会死亡中的甲基纤维素的情况下。 TGF -β是直接添加到胶原METHOCEL混合，因为我们发现，细胞的反应较差的TGF -β时，这个因素是添加胶原蛋白的中型运顶部。不过，最好是添加胶原蛋白不能直接溶解在DMSO的化学抑制剂，自DMSO icecold胶原METHOCEL混合沉淀物。因此，我们添加这些化合物中的胶原上的媒介。
随后，细胞嵌入在胶原蛋白3梦诗ional的环境，让他们侵入到胶原基质。比较不同MCF10A1细胞株的侵入属性时，我们发现，基底入侵以及TGF -β诱导的入侵增加从相对良性的货币供应量M1细胞，在更高层次转化的RAS - M2的衍生，在更高的层次转移性M4的变种。因此，侵入属性与这三个细胞系7,8,14侵略性的相对状态。
球体嵌入到胶原蛋白是在检测的关键一步。可能难以执行前几次的检测时，检测枪头球体。谁也回避不了，通过收集管的球体，纺纱下来，去除上清和重新悬浮在胶原蛋白METHOCEL混合的球体。这就需要更多的球体作为输入，在此过程中失去了约50％的球体。此外，多个球体5月底在一个良好，也许是太接近对方来分析。此外，它是首选有不超过每以及椭球体，以避免球体可能互相干扰（如分泌生长因子）的可能性。因此，再悬浮一步是关键的一步，使用这种方法。
这种检测的限制，我们分析了在2维平面的3维检测。在图3和4可以看到，大多数细胞通常在同一平面入侵。然而，球体非常接近的边缘位于以及侵入深度一般从分析中排除，原因是。当然，这将可能为了得到更精确的结果来执行3D分析，。但是这需要复杂的硬件和软件，造福，而不是使用面积的计算量可能不会超过麻烦。特别是因为我们发现，在起始大小的变化在二维测量的三维球体，一般只有5-10％。
这种方法的另一个缺点是成像是一个耗时的步骤，因为球体是在不同的高度，这阻碍了自动成像。分析步骤也非常耗时，而且需要良好的对比度从球体基质的图片，以使Photoshops能力自动识别球体的边界。情况下，对比度过低，人们可以很容易适应的亮度和对比度，使用水平，并在Photoshop曲线命令。另一种方法是增加对比度将使用一个重要的荧光染料。
作为一个定量的另一种方式，可以借鉴球体周围的区域，手动使用图像J.的影像提前J是它是免费的（http://rsbweb.nih.gov/ij/）。然而，我们发现入侵球体的形状不规则的手工绘图，图像J一个耗时的步骤相比，Photoshop的快速选择工具。
该协议可以适应，以调查入侵其他细胞系，细胞能够形成，诱导细胞株的入侵可能会有所不同浓度的TGF -β的最佳spheroids.Furthermore。在我们所有的细胞系中，TGF -β诱导在5毫微克/毫升的侵袭，虽然M4更好地执行时，使用2毫微克/毫升。
此外，此法可适应其他的生长因子，如上皮生长因子（EGF）或肝细胞生长因子（HGF），来衡量入侵响应。
在我们的实验基础和TGF -β诱导的入侵是治疗I型TGF -β受体抑制剂SB - 431542，强烈抑制。这是一个原则的证明，可以在本实验中使用的化学抑制剂。其他化学抑制剂，如基质金属蛋白酶抑制剂，也被成功地用于在浓度tions建议由单层细胞培养制造商。
掌握了这种技术后，可以测试化学抑制剂，击倒或侵袭基因表达的影响。此外，扩大了检测，以24以及格式，可以分离出的RNA用苯酚 - 氯仿为基础的方法（如Trizol法®或Tripure）硅胶柱的清理。这种RNA可用于实时定量PCR。
我们的球体的入侵检测类似于体内过程比2D入侵模式更密切的，因为在球体细胞在不同的代谢状态，并在更自然时尚的交互及其周围10。我们已经完成碘化丙啶和荧光素二醋酸染色后，入侵检测，检查死和活细胞，并指出，同样在体内的情况，在该中心的细胞死亡，坏死，而在t细胞他外缘是代谢活跃。
我们使用I型胶原蛋白，而基质胶，因为几份报告表明，在乳腺癌细胞外基质的组成经常改变，纤维化僵硬灶我内容具有很高的胶原蛋白。它已被证明，我的内容，增加胶原蛋白促进乳腺癌的形成和入侵 15和更大的发病率转移 16 。因此，许多肿瘤细胞通过胶原侵入我丰富的环境，以便转移。
在过去的几十年里已经制定了几个3D模型。细胞可完全嵌入在一个矩阵内或放置在上面的矩阵或聚合物支架17,18。比塞尔和同事开发出一种三维模型，细胞生长在一个重组基底膜（RBM）矩阵。这个模型提供了一种快速检测，以区分正常的和恶性乳腺上皮细胞，但侧重于细胞形态19,20。恶性肿瘤21,22鲜明MCF10A细胞株的形态发生和组织呈负相关。在其他三维模型的多细胞球体显示相同的电阻作为他们的父母体内的细胞株的细胞毒性药物，而在单层细胞没有这样做11。 MCF10A细胞系中的三维文化已被用来评估激酶抑制剂23的敏感性。我们的球体模型的补充，特别注重入侵这些化验。
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Disclosures
没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢肯岩田（OSI制药，纽约，美国）试剂和弗雷德米勒（芭芭拉安Karmanos癌症Intitute，底特律，美国）细胞株。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck & Co., Inc. | 9533 | |
| 96-well suspension plates | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates | Greiner Bio-One | 655 180 |
References
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