Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Summary

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Abstract

TGF-β heeft tegengestelde rollen in borstkanker progressie door te fungeren als een tumor suppressor in de beginfase, maar het stimuleren van invasie en metastase in een later stadium ^1,2. Bovendien is TGF-β vaak tot overexpressie gebracht in borstkanker en de uitdrukking ervan correleert met een slechte prognose en metastase ^3,4. De mechanismen waarmee TGF-β induceert invasie niet goed begrepen.

TGF-β lokt haar cellulaire reacties via TGF-β type II (TβRII) en type I (TβRI) receptoren. Bij de TGF-β-geïnduceerde heteromeric complex vorming, TβRII fosforyleert de TβRI. De geactiveerde TβRI initieert zijn intracellulaire canonieke signaalroute door fosforylatie receptor Smads (R-Smads), dat wil zeggen Smad2 en Smad3. Deze geactiveerde R-Smads vorm heteromeric complexen met Smad4, die zich ophopen in de kern en het reguleren van de transcriptie van doelwitgenen ^5. In aanvulling op de eerder described Smad pad, receptor activering resulteert in de activering van een aantal andere niet-Smad signaalwegen, bijvoorbeeld Mitogeen Activated Protein Kinase (MAPK) wegen ^6.

De studie van de rol van TGF-β in verschillende stadia van borstkanker, hebben we gebruik gemaakt van de MCF10A cel systeem. Dit systeem bestaat uit spontaan vereeuwigd MCF10A1 (M1) borst epitheelcellen ^7, de H-RAS getransformeerd M1-derivaat MCF10AneoT (M2), die premaligne letsels veroorzaakt bij muizen ^8, en de M2-afgeleide MCF10CA1a (M4), dat werd vastgesteld op basis van M2 xenografts en vormen hoogwaardig carcinomen met de mogelijkheid om uitzaaien naar de longen ^9. Dit MCF10A serie biedt de mogelijkheid om de reacties van cellen te bestuderen met verschillende graden van maligniteit die niet vertekend door een verschillende genetische achtergrond.

Voor de analyse van TGF-β-geïnduceerde invasie genereerden wij homotypic MCF10A sferoïde celculturen embeT OEGEVOEGDE in een 3D-collageen-matrix in vitro (figuur 1). Dergelijke modellen sterk lijken op menselijke tumoren in vivo door de oprichting van een gradiënt van zuurstof en voedingsstoffen, wat resulteert in actieve en invasieve cellen aan de buitenkant en rustende of zelfs necrotische cellen in de binnenkant van de sferoïde ^10. Sferoïde gebaseerde testen hebben ook aangetoond dat resistentie tegen geneesmiddelen beter samenvatten dan monolaagculturen ^11. Dit MCF10 3D-model-systeem liet ons toe om de impact van de TGF-β signalering te onderzoeken op de invasieve eigenschappen van borst-cellen in verschillende stadia van maligniteit.

Protocol

1. Voorbereiding van de Methocel oplossing (500 ml)

1. Autoclaaf 6 g methylcellulose in een 500 ml fles met een magneetroerder.
2. Los van de methylcellulose in 250 ml voorverwarmd DMEM/F12 zonder serum (60 ° C) gedurende 20 minuten.
3. Voeg 250 ml van DMEM/F12 (RT) met 10% paard serum. Mix 's nachts (4 ° C).
4. Wis de oplossing door centrifugeren (5000g, 2h, 4 ° C).
5. Neem het heldere zeer viskeuze oplossing voor een nieuwe buis (ongeveer 90-95% van de voorraad-oplossing).
6. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.

2. Sferoïde cultuur

1. Bereid een 20% Methocel-oplossing (10 ml en 40 ml Methocel groeimedium).
2. Twee keer wassen cellen met PBS, voeg 0,1% trypsine en incubeer cellen bij 37 ° C
3. Resuspendeer cellen in groeimedium en tellen de cellen.
4. Maak een suspensie van 10 000 cellen per ml in 20% Methocel.
5. Voeg de celsuspensie aan de 96 goed met ronde bodem suspension platen (100 ul per putje).
6. De volgende dag, controleer dan de bolvormige formatie in de suspensie platen. Sferoïden klaar voor gebruik na 1-3 dagen.

3. Vervaardiging van collageen

1. Voor te bereiden op het ijs een oplossing van 8 ml collageen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH en 3 druppels 0,1 N HCl. Controleer of de pH 7,4 door het spotten van een deel van de oplossing op pH-indicator strips. Stel de pH indien buiten bereik.
2. Voeg 50 ul van geneutraliseerd collageen-oplossing in de putjes van een plaat met 96 putjes
3. Incubeer bij 37 ° C totdat het collageen is gestold (90 min).
4. Bereid Methocel-collageen-ligand-oplossingen op het ijs: voor elke ligand pipet een deel van de oplossing van collageen. Voeg 20 ng per ml TGF-β collageen. Na verdunning met Methocel en de verspreiding over de verschillende lagen, zal de uiteindelijke concentratie van TGF-β worden 5 ng / ml Meng door vortexen. Voeg een deel van Methocel-oplossing. En door vortexen gemengd.

4. Sferoïde insluitenDing

1. Plaats een 200 ul tip dat ongeveer 5 mm van de tip afgesneden heeft, op een 200 ul pipet. Zuigen een sferoïde met de pipet en zorgvuldig het medium afzien in een leeg bord. Kijk als de bolvormige blijft binnen de tip. De sferoïde is zichtbaar als een witte stip. Zonder dat het loslaten van de zuiger, zuigen 100 ul collageen-Methocel mengsel en afzien van de spheroïde in het collageen mengsel in een collageen gecoate 96 well. Doe dit voor 12 sferoïden voor elke conditie.
2. Laat collageen ten minste 30 minuten stollen bij 37 ° C
3. Verwijder de luchtbellen met een 200 ul tip.
4. Voeg 50 pl medium met 1,6% serum en inhibitoren opgelost in DMSO. Voor de SB-431542 toe te voegen 4 pl stockoplossing (10 mm) tot 1 ml medium. Na de diffusie, zal de uiteindelijke concentratie van de remmer worden 10 uM. TGF-β en remmers blijven de loop van het experiment. Maak foto's van de sferoïden onder de microscoop met behulp van 40x vergroting.
5. Na 48h van de stimulatie met TGF-β en / of remmers, foto's nemen van de sferoïden onder de microscoop met behulp van 40x vergroting.
6. Meet de oppervlakte van de binnenvallende sferoïden na 2 dagen en trek het startgebied. Het meten van de oppervlakte van een sferoïde: Open het beeld van de sferoïde in Adobe Photoshop Extended (figuur 2A) en selecteer het gereedschap Snelle selectie (figuur 2B). De muisaanwijzer verandert in een cirkel met een 'plus' (+) teken (figuur 2C). Tijdens het slepen met de cursor over de afgeplatte bol is, zal Photoshop herkent de grenzen van de sferoïde. Als een gebied buiten de sferoïde is geselecteerd, kan dit gebied worden uitgesloten van de selectie door op de Alt-toets of door gebruik te maken van de negatieve selectie tool die wordt aangegeven door een (-) teken in de werkbalk. De cursor verandert in een cirkel met een 'min' (-) teken en door het slepen van de cursor over de verkeerd gekozen gebied, is dit gebied uit de selectie verwijderd (figuur 2D). Indien nodig, meerdere regio's kunnen worden geselecteerd door op de ShIFT-knop. Om te werken nauwkeuriger, kan de grootte van de muisaanwijzer worden aangepast door het veranderen van de borstel diameter in de werkbalk (figuur 2E). Wanneer de hele sferoïde is geselecteerd, is de oppervlakte van de selectie berekende via analyse-maatregel in de menubalk of door te drukken op Ctrl + Shift + M (figuur 2F). De meting opname venster verschijnt met de bestandsnaam en het gebied van de selectie in pixels, evenals andere gegevens (figuur 2G). Als er meerdere selecties worden gemeten, de eerste regel geeft de som van alle gebieden. De metingen van de individuele selecties worden gepresenteerd in de lijnen hieronder. De gegevens van alle metingen kunnen worden geëxporteerd naar een tekstbestand en geopend in Excel.

5. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van de bolvormige assay met MCF10A1 (M1) normale borst-epitheliale cellen, H-RAS getransformeerd MCF10AneoT (M2) cellen en M2-afgeleide MCF10CA1a (M4) wordt gegeven in figuur 3. M1 cellen toonde slechts zwakke invasie zonderstimulatie, maar viel significant beter op stimulatie door TGF-β. In tegenstelling, de RAS-getransformeerde M1-M2 afgeleide binnengevallen efficiënt al zonder toevoeging van stimuli, en dit werd verder verhoogd 4-5 keer op TGF-β behandeling. M4 cellen toonde de sterkste invasie, zowel met als zonder TGF-β toevoeging.

Vervolgens onderzochten we of we konden met de TGF-β-geïnduceerde invasie grijpen in dit bolvormige model met behulp van chemische remmers. Voor dit doel gebruiken we SB-431542, een ATP-analoog en selectieve remmer van de kinase-activiteit van TβRI, evenals activine type IB receptor (ActRIB) en activine receptor-like kinase (ALK) 7 ^12. Zoals verwacht, SB-431542 krachtig remde TGF-β-geïnduceerde invasie van M1, M2 en M4 cellen (afb. 4), wat aangeeft dat TGF-β-geïnduceerde invasie is TβRI-kinase afhankelijk. Daarnaast is de basale invasie van de sferoïden ook werd sterk geremd, wat suggereert dat basale inval is ook deonafhankelijke op de TGF-β.

Figuur 1. Stroomdiagram van de 3D-sferoïde test. Eerst worden de cellen geplateerd onder niet-klevende omstandigheden in u-vormige suspensies platen. Cellen aggregrate in multcellular sferoïden en kan worden ingebed in een collageen matrix. In dit collageen matrix, zijn ze in staat om binnen te vallen.

Figuur 2. Kwantificering van de oppervlakte van de sferoïden met behulp van Adobe Photoshop Extended. (A) Het beeld van de bolvormige wordt geopend in Adobe Photoshop Extendend (B) Selectie van het gereedschap Snelle selectie (C) Het slepen van de cursor over de bolvormige op het gebied van de bolvormige (D) Verwijdering van een wongly opgenomen gebied met behulp van de te selecteren negatieve gereedschap Snelle selectie (E) Aanpassing van de borstel grootte van het gereedschap Snelle selectie om nauwkeuriger Selecteer het gebied dat (F) Selectie van demeting op te nemen opdracht (G) Voorbeeld van een meting op te nemen.

Figuur 3. TGF-β-geïnduceerde invasie van sferoïden van spontaan vereeuwigd MCF10A1 (M1) (A), RAS-getransformeerde MCF10AneoT (M2 (B) en haar uitgezaaide afgeleide MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 en M4 spheroids embedded in collageen werden behandeld met 5ng/ml van TGF-β voor 48u zoals aangegeven. AC vertegenwoordiger van foto's genomen op de dag van inbedding en twee dagen later. D Relatieve invasie werd gekwantificeerd als gebied verschil op dag 2 minus dag 0. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± sd Aangepast uit ^13.

Figuur 4. Basal en TGF-β-geïnduceerde sferoïde invasie wordt geremd by SB-431542. M1, M2 en M4 spheroids werden ingebed in collageen en behandeld met TGF-β 5ng/ml en / of 10 uM SB-431.542 zoals aangegeven. Vertegenwoordiger van foto's genomen na 2 dagen (A). Relatieve invasie werd gekwantificeerd als gebied verschil op dag 2 minus dag 0 (B). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± sd Aangepast uit ^13.

Discussion

We hebben een sferoïde model waarin MCF10A1 cellen en zijn kwaadaardige derivaten binnen te vallen in een collageen matrix in een TGF-β-afhankelijke manier. Eerst worden sferoïden gevormd in 96-wells ronde bodem schorsing platen in de aanwezigheid van methylcellulose. Natuurlijk kan ook de U-vormige poly-HEMA gecoate platen worden gebruikt voor dit doel. Methylcellulose is absoluut noodzakelijk in deze stap, aangezien cellen zullen sterven in de afwezigheid van methylcellulose. TGF-β wordt direct toegevoegd aan de collageen-Methocel mengsel omdat we vonden dat de cellen reageerden minder goed op de TGF-β bij deze factor werd toegevoegd aan het medium op bovenkant van het collageen. Toch is het raadzaam om chemische remmers opgelost in DMSO niet direct in het collageen toe te voegen, aangezien de DMSO precipitaten in het ijskoude collageen-Methocel mengsel. Daarom voegen we deze verbindingen in het medium op de top van het collageen.

Vervolgens worden de cellen ingebed in een collageen 3-dimenional omgeving om hen in staat binnen te dringen in de collageen matrix. Bij het vergelijken van de invasieve eigenschappen van de verschillende MCF10A1 cellijnen vonden we dat basale invasie als TGF-β-geïnduceerde invasie steeg van de relatief goedaardige M1 cellen, naar hogere niveaus in de RAS-getransformeerde M2-derivaat, nog hogere niveaus in de gemetastaseerde M4 variant. Zo, de invasieve eigenschappen gecorreleerd met de relatieve stand van de agressiviteit van deze drie cellijnen ^7,8,14.

De inbedding van de bolvormige in het collageen is een belangrijke stap in de test. De detectie van de sferoïde in de pipetpunt kan moeilijk zijn bij het uitvoeren van de test voor de eerste paar keer. Men kan dit voorkomen door het verzamelen van de sferoïden in een buis, spinnen ze naar beneden, het verwijderen van supernatant en resuspendeer de sferoïden in collageen-Methocel mengsel. Dit vereist meer sferoïden als input als ongeveer 50% van de sferoïden is verloren tijdens dit proces. Bovendien, meerderesferoïden kunnen tot goed eindigen in een en misschien te dicht bij elkaar liggen te analyseren. Daarnaast verdient het de voorkeur om niet meer dan een sferoïde per goed hebben voor de mogelijkheid dat sferoïden kunnen interfereren met elkaar (bijvoorbeeld door het afscheiden van groeifactoren) te vermijden. Daarom is de resuspensie stap is een belangrijke stap met deze methode.

Een beperking van deze test is dat we een 3-dimensionale test in een twee dimensionaal vlak te analyseren. Zoals te zien is in figuur 3 en 4, de meeste cellen binnen te dringen meestal in hetzelfde vlak. Echter, sferoïden die zich zeer dicht bij de rand van de put binnen te vallen over het algemeen meer in de diepte en zijn om die reden uitgesloten van de analyse. Natuurlijk zou het mogelijk zijn om de analyse uit te voeren in 3D, om een ​​nauwkeuriger resultaat te krijgen. Maar dit vereist geavanceerde hardware en software en het voordeel voor de berekening van het volume in plaats van het gebruik van het gebied kunnen niet opwegen tegen de moeite. Vooral omdat we vonden dat de variatie bij het opstarten groottevan de 3-dimensionale sferoïden zoals gemeten in 2D, is over het algemeen slechts 5-10%.

Een ander nadeel van deze methode is dat de beeldvorming is een tijdrovende stap, aangezien de sferoïden bevinden zich op verschillende hoogtes, die geautomatiseerde beeldvorming belemmert. Ook de analyse stap is tijdrovend en vereist foto's met een goed contrast van sferoïde op de matrix om gebruik te maken van photoshopt mogelijkheid om automatisch herkennen de rand van de sferoïde. In het geval dat het contrast te laag is, kan men gemakkelijk aanpassen van de helderheid en het contrast met behulp van de Niveaus en Curven commando's in Photoshop. Een andere manier om het contrast te verhogen zou het gebruik een belangrijke fluorescente kleurstof worden.

Als een alternatieve manier van kwantificering, kon men het gebied te trekken rondom de bolvormige handmatig met Image J. Een voorschot van Image J is dat het is freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Echter, we vonden de handleiding tekening van de onregelmatige vorm van de binnengevallen sferoïden in Image Jeen tijdrovende stap in vergelijking met Quick Selection Tool van Photoshop.

Het protocol kan worden aangepast aan invasie van de andere cellijnen te onderzoeken, op voorwaarde dat de cellen in staat zijn om spheroids.Furthermore, de optimale concentratie van TGF-β aan invasie van de cellijn te induceren zou kunnen andere vorm. In al onze cellijnen, TGF-β induceert invasie op 5 ng / ml, hoewel M4 beter presteert bij het gebruik van 2 ng / ml.

Bovendien kan deze test worden aangepast aan invasief respons te meten aan andere groeifactoren, zoals de epitheliale groeifactor (EGF) of hepatocyt groeifactor (HGF).

In onze testen van de basale en TGF-β-geïnduceerde invasie werd sterk geremd door behandeling met SB-431542, een remmer van het type I receptor voor TGF-β. Dit is een proof of principle dat chemische remmers gebruikt kunnen worden in deze test. Andere chemische remmers, zoals MMP-remmers, werden ook met succes gebruikt bij concentratiesties aanbevolen door de fabrikant voor monolaag celcultuur.

Bij het beheersen van deze technieken kan een test het effect van chemische remmers, knockdown of overexpressie van genen op invasie. Bovendien, door het opschalen van de test om een ​​24 well formaat, kan een isolaat RNA met behulp van een fenol-chloroform-gebaseerde methode (bijvoorbeeld TRIzol ® of Tripure), gevolgd door een silica-kolom op basis van clean-up. Dit RNA kan gebruikt worden voor kwantitatieve real-time PCR.

Onze sferoïde invasie test lijkt op de in-vivo-proces beter dan 2D-invasie modellen, omdat de cellen in sferoïden zijn in verschillende metabole toestanden en de interactie in meer natuurlijke wijze met hun omgeving ^10. Wij hebben propidiumjodide en Fluoresceïne diacetaat kleuring om voor de dode en levende cellen controle na de invasie assay en merkte op dat op dezelfde wijze als de in vivo situatie, de cellen in het centrum zijn dood en necrotische, terwijl de cellen op thij buitenste rand zijn metabolisch actief.

We gebruikten type I collageen in plaats van Matrigel, omdat een aantal rapporten is gebleken dat de samenstelling van de extracellulaire matrix in borstkanker vaak is veranderd, wat resulteert in fibrotische stijf haarden met een hoog collageen I content. Het is aangetoond dat een toename van collageen I content borstkanker vorming en de invasie ¹⁵ bevordert en wordt geassocieerd met een grotere incidentie van metastase ^16. Veel tumorcellen moeten dus binnen te dringen door middel van een collageen I rijke omgeving om te metastaseren.

Meerdere 3D-modellen werden ontwikkeld in de afgelopen decennia. Cellen kunnen zowel volledig worden ingebed binnen in een matrix of geplaatst op de top van een matrix of een polymeer steiger ^17,18. In een 3D-model, ontwikkeld door Bissell en collega's, werden cellen gekweekt in een gereconstitueerde basaal membraan (RBM) matrix. Dit model biedt een snelle test om onderscheid te maken tussen normale en malignemamma-epitheel, maar richt zich op mobiele morfologie ^19,20. Morfogenese en de organisatie van de verschillende MCF10A cellijnen omgekeerd gecorreleerd met maligniteiten ^21,22. In andere 3D-modellen meercellige sferoïden toonde dezelfde weerstand om cytotoxische geneesmiddelen als hun ouders cellijn in vivo, terwijl cellen in monolagen nagelaten dit te doen ^11. Ook 3D culturen van MCF10A cellijnen zijn gebruikt om de gevoeligheid voor kinase-remmers ²³ te beoordelen. Onze sferoïde model vult deze testen door specifiek te focussen op invasie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
pH indicator strips	Merck & Co., Inc.	9533
96-well suspension plates	Greiner Bio-One	650 185
96-well adhesion TC plates	Greiner Bio-One	655 180