En forenklet teknik til at producere et iskæmisk sår model

Summary

Vi har udviklet en minimalt invasiv teknik til at skabe en kanin iskæmisk øre sår model ved at dividere den centrale arterie og nerve og kranie neurovaskulær bundt. En subkutan tunnel derefter skærer alle subkutane væv. Denne procedure forårsager minimal hud forstyrrelser og kan sikkert bruges i diabetiske dyr.

Abstract

En væsentlig hindring i den nuværende diabetiske sår forskning er en mangel på en iskæmisk sår model, der kan anvendes sikkert i diabetiske dyr. Lægemidler, som fungerer godt i ikke-iskæmiske sår fungerer muligvis ikke i humane diabetiske sår, fordi vaskulopati er en væsentlig faktor, der hindrer heling af disse sår. Vi udgav en artikel i 2007, beskriver en kanin øre iskæmisk sår model skabt af en minimalt invasiv kirurgisk teknik. Siden da, har vi yderligere forenklet procedure for lettere betjening. På det ene øre, blev tre små hud indsnit foretaget på de vaskulære pedicles, 1-2 cm fra øret base. Den centrale arterie blev ligeret og skåret langs med nerve. Hele kraniel bundt blev skåret og ligeret, så kun den caudale gren intakt. En rundtgående subkutan tunnel blev foretaget gennem indsnit, for at skære subkutane væv, muskler, nerver, og små fartøjer. Det andet øre blev anvendt som en ikke-iskæmisk kontrol. Fire sår blev foretaget på den ventrale side of hvert øre. Denne teknik giver 4 iskæmiske sår og 4 ikke-iskæmiske sår i en dyr for parvise sammenligninger. Efter operationen blev det iskæmiske øret afkøles og cyanotiske og udviste reduceret bevægelse og en mangel på impuls i ørearterien. Hudtemperatur på den iskæmiske øret var 1-10 ° C lavere end den normale øre, og denne forskel var opretholdt i mere end en måned. Ørevæv højenergi-phosphatkilde indholdet var lavere i den iskæmiske øret end kontrollen øret. Sårhelende var længere i den iskæmiske øret end i den ikke-iskæmiske øret, når den samme behandling blev anvendt. Den teknik er nu blevet anvendt på mere end 80 kaniner, hvor 23 var diabetiske (diabetes tidsrum i intervallet fra 2 uger til 2 år). Ingen enkelt kanin har udviklet nogen kirurgiske komplikationer, såsom blødning, infektion eller brud i huden indsnit. Modellen har mange fordele, såsom lille hud afbrydelse længere iskæmisk tid og højere succesrate, sammenlignet med mange andre modeller. Den can benyttes sikkert i dyr med reduceret modstand, og kan også ændres for at opfylde forskellige prøvningskrav.

Protocol

1. Anatomisk Basis

Kaninen øre har været et yndet undersøgelse materiale til sårpleje siden begyndelsen af 20 ^århundrede. Øret leveres af tre karstrengene (central, kraniel og caudale), den centrale bundt er den største, mens skibet i kranie og caudale bundter varierer i størrelse. Lejlighedsvis kan caudale arterie være fraværende. ¹ Alle disse fartøjer, let kan identificeres på den dorsale side efter øret er barberet (fig. 1). På den ventrale side er den distale huden ikke modtage blodforsyning fra den proximale fartøjer. De tre fartøj bundter på den dorsale øret har adskillige grene, der trænger gennem brusken at tilvejebringe blodforsyning til den distale ventrale huden (fig. 2). I nogle kaniner også en meget lille subkutan beholderen foregår på den ventrale side, som leverer blod til ikke mere end 1/3 af den ventrale huden. I et åbent omkredsen incision i huden, er der essenligt ikke blødning fra en ventral incision.

2. Kirurgisk procedure

1. Kanin vejes og ørerne barberet, sammen med bagsiden af ​​halsen.
2. En præmedicinering af buprenorphin (0,01 mg / kg) gives IM én time før kirurgi.
3. Anæstesi induceres med en blanding af ketamin (50 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) intramuskulært.
4. Kaninen er beskyttet med en varmepude under kirurgi, er øjnene beskyttet med salve, og vitale tegn overvåges under kirurgi.
5. Det kirurgiske område fremstilles aseptisk med en kirurgisk skrubning og draperes, således at de to ører udsættes for.
6. Det ene øre gøres iskæmisk, mens det andet øre tjener som en parret non-iskæmisk kontrol.
7. De tre vaskulære pedicles er identificeret af de arterier og vener.
8. Anvendelse af en # 15 blad er tre små lodrette snit (1-1,5 cm) på de vaskulære pedicles, ca 1-2 cm fra øret base.
9. Den centrale vene erisoleret fra de omgivende væv og en sutur anvendes til at omslutte den til tilbagetrækning. Den centrale arterie ligeres med 4-0 suturer og delt.
10. Den medfølgende centrale nerve skæres også.
11. Hele kraniale stilken ligeres og delt.
12. Den caudale stilken bevares.
13. En subkutan tunnel sker gennem de 3 indsnit. Dette opnås ved stump dissektion med en klemme og skarpe dissektioner med en kniv og saks. Alle de subkutane væv, muskler, nerver, og små vaskulære grene er afbrudt. De små vasculatures nedenunder dermis er fuldstændig delt. Alle de subkutane væv skæres til niveauet af brusk med bladet.
14. Yderligere skarpe og stumpe dissektioner bruges til at rydde op i basen, efterlader en nøgen brusk omkring 5-10 mm brede.
15. Denne procedure afbryder alle de subkutane vaskulære grene for at forhindre dem i at der hurtigt kan udarbejdes soeskende.
16. Blødning erminimal. Hvis der er nogen, er det let styres af gaze kompression, uden behov for elektrokauterisation.
17. Huden inde i øret udfører ikke meget blodforsyning og dermed ikke indsnit.
18. De 3 snit i huden er lukket med 4-0 eller 5-0 suturer, og dækket med steril gaze.
19. Proceduren resulterer i 3 små snit i huden, og påtager sig langt mindre skader i huden end en åben operation.
20. Fire cirkulære fuld tykkelse hudsår er skabt på den ventrale side af hvert øre med et 6 mm rustfrit stål dorn. Afstanden mellem de sår er mindst 20-30 mm. Huden inde i stemplet såret fjernes fra brusk. Den perichondrium også fjernes med huden eller separat. Den side, som granulering og epitelisering finde sted, er brusk, men brusk er ikke perforeret (fig. 3).
21. Når sårene på begge ører er fuldført, er prøvning lægemiddel påføres den ene side af to sår, mens kontrolgruppen lægemidlet ApplIED til sår på den anden side. En okklusiv forbinding (Tegaderm, 3M) anvendes til at dække såret. Dette forhindrer de sår bliver tørret.
22. Sårene på bunddelen af ​​øret normalt heler hurtigere end sår på toppen af ​​øret. Til sårheling sammenlignende undersøgelse, anbefales det at sammenligne de to sår på den ene side med de to sår på den anden side, eller at sammenligne den øverste og nederste sår separat.

3. Postoperative pleje

1. En Duragesic lap fastgjort til bagsiden huden for at frigøre Fentanyl (25 ug / time) i 2-3 dage for at mindske muligheden smerte.
2. Kaninerne fik fri adgang til mad og drikke.
3. Bandageskift udføres dagligt. De gamle forbindinger fjernes, og sårene renset med sterile vatpinde. Digitale fotos er taget til sammenligning. Nye forbindinger anvendes, og sårene er dækket igen ved Tegaderm. Ingen bedøvelse er nødvendig under dressing lmAnges.
4. Hudtemperaturen måles dagligt på hvert øre til sammenligning.
5. Yderligere øre blodcirkulationen kan måles med en transkutan oxygenspænding meter eller en laser Doppler flowmeter.
6. Suturerne kan fjernes efter en uge.
7. For ikke-diabetiske dyr, sædvanligvis det meste af øret sår heler i løbet af 2-3 uger.

4. Potentielle komplikationer og hvordan man undgår dem

Dette minimalt invasiv kirurgi er sikkert og komplikationer er sjældne. Bortset fra en overgangsperiode postoperativ mild øre ødem, ingen af ​​vores kaniner har haft alvorlige kirurgiske komplikationer. Ikke desto mindre er der adskillige potentielle komplikationer for denne procedure:

1. Blødning. Blødning kan forekomme i indskæringerne, hvis hæmostase er ufuldstændig, eller hvis en større blodkar (såsom et af de vigtigste stilken fartøjer) er beskadiget. Dette kan let undgås ved omhyggelig dissektion. Ud over de tre store vaskulære bundter, der enre mange mindre subkutane vaskulære grene. Når subkutan tunnel er gjort, er disse fartøjer skæres, men ingen binding er nødvendig. Hæmostase kan opnås blot ved gaze tryk. Dette er let gjort ved at indsætte et hjørne af gaze ind i tunnelen i nogle få minutter. Før du lukker snittet, så sørg for ikke aktiv blødning er til stede.
2. Incision infektion og aabning: Disse komplikationer kan opstå, hvis de indsnit er forurenet. Dette kan undgås ved anvendelse af strenge af aseptisk teknik og ikke antibiotikum er nødvendig. Men, er, hvis infektionen forekommer, passende dræning og bandageskift behov.
3. Ear ødem: På grund af vaskulære ligeringerne og afbrydelse af lymfe cirkulation, kan mild øre ødem præsentere et par dage. Imidlertid forsvinder i sig selv og ingen behandling er nødvendig.

5. Repræsentative resultater

Siden 2007 har vi brugt denne procedure i mere end 70 kaniner, herunder 23 diabetisk enimals. I den diabetiske gruppe, blev kirurgi udføres på forskellige diabetiske tidspunkter: syv kaniner havde to ugers diabetisk tid, fire af dem havde to måneder, ti havde 12 måneder, og 2 havde 24 måneders diabetisk tid.

Umiddelbart efter operationen viste det iskæmiske øret kølig og cyanotisk, med mild ødem. Den vigtigste ørearterie-den centrale arterie-havde en stærk impuls i den normale øre, men denne puls var ikke til stede i den iskæmiske øret. Ear bevægelse blev reduceret, men ikke helt forsvinde. Huden viste klare fordybninger over tunnelen, men ingen iskæmi eller nekrose blev fundet i dyr (fig. 4).

De hudtemperatur af den normale og iskæmiske ører blev målt med et digitalt termometer (Omron af Omron Healthcare, Bannockburn, IL, eller en type K infrarødt stedet termometer fra Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Temperaturforskelle mellem de ikke-iskæmiske og iskæmisk øre varierede fra 1 til 10 ° C, wed fleste kaniner falder inden for området 2-6 ° C. Fig. 5 viser de gennemsnitlige temperatur forskelle fra 30 kaniner. Temperaturforskellen var højere i de første dage efter kirurgi, faldt gradvist efter dag 15, men var stadig opretholdes på udgangen i en måned.

Væv højenergi-phosphatkilde indhold blev målt hos nogle dyr efter at de blev aflivet. Seks vævsprøver blev taget fra hvert øre og højenergi-phosphatkilde indholdet blev målt ved HPLC. Både ATP og samlede energibehov koncentrationer var højere i de normale øre end i iskæmiske ørerne. Fig. 6 viser et eksempel på en kanin aflivet 23 dage efter kirurgi. De gennemsnitlige væv ATP indhold var 0,349 ± 0,047 gmol / g (middelværdi ± SD) på normale øre vs 0,237 ± 0,059 gmol / g i den iskæmiske øret (p <0,005). Den gennemsnitlige totale energi (ATP + ADP + AMP) var 0,882 ± 0,137 gmol / g i normale øre vs 0,556 ± 0,115 gmol / g i ische mic øre (p <0,001).

Sårhelende gange var altid længere for den iskæmiske øret end for den ikke-iskæmiske øret i alle grupper (ikke-diabetisk eller diabetisk). Fig. 7 viser en sammenligning af heling mellem 26 par af sår på iskæmiske og ikke-iskæmiske ører. Healing gange varierede fra 13 til 18 dage (gennemsnit 14,9 ± 1,6 dage) på de normale ørerne vs 17 til 27 dage (gennemsnit 20,5 ± 3,4 dage) på de iskæmiske ørerne (p = 0,001). Sårhelingsmodeller gange i alderen og diabetisk kaniner var meget længere, især når diabetisk tid var mere end 12 måneder.

I disse kaniner, er alle de indsnit helede normalt uden nogen komplikationer, herunder kaniner med 24 måneder diabetisk tid Figur 8 en histologi prøve viser helet subkutan tunnel i hvilken muskel er fraværende, og erstattes af fibrøse væv. Imidlertid huden er intakt.

/ 3341fig1.jpg "/>
Figur 1. Kaninøret leveres af tre vaskulære bundter. Den centrale er det største, kraniale er mindre, og den kaudale bundtet er den mindste. Disse fartøjer let ses på overfladen efter øret barberes.

Figur 2. De tre fartøjer bundter på den dorsale øret leverer blod ikke kun den dorsale hud, men også den ventrale huden gennem gennemtrængende fartøjer. Pilen viser de gennemtrængende fartøjer gennem brusken. Det indsatte billede viser tværsnit af disse fartøjer.

Figur 3. Fire 6 mm sår dannes på den ventrale side af øret, og perichondrium fjernes også. Den side, som granulering og epitelisering finde sted, er brusk, men brusk er ikke perforeret. Den 3 Smal l snit i huden er lukket med meget lidt hud forstyrrelser.

Figur 4. Efter hudincisioner er lukket, er fordybning over subkutan tunnel tydeligt ses.

Figur 5. Den gennemsnitlige hudtemperatur forskel mellem den normale og iskæmisk øre 30 kaniner. De tidlige forskel ligger i området fra 7 ° C til 10 ° C efter kirurgi. Forskellen falder gradvist, men stadig opretholdes på udgangen i en måned.

Figur 6. Ørevæv højenergi-phosphatkilde indhold reduceres i den iskæmiske øret sammenlignet med non-iskæmisk øret på 23 dage efter kirurgi (p <0,001).

41/3341fig7.jpg "/>
Figur 7. Sårheling er længere i den iskæmiske ørerne end de ikke-iskæmiske ører (26 sår hver). Heling er defineret som genoprettelse af integritet til beskadiget væv, dvs fuldstændig reepitelisering af sårsteder.

Figur 8. Histologi prøve viser øret del indeholdende subkutan tunnel. Den helede væv er tyndere end normalt øre, det oprindelige skeletmuskel er fraværende, og erstattes af fibrøse væv. Imidlertid huden er intakt.

Discussion

Diabetes rammer 23,6 millioner mennesker i USA, ^2,3 og 15-20% af disse patienter udvikler fodsår i deres levetid, ^4,5 til en årlig behandling omkostninger på mere end $ 25 mia. ^3,6 Men selv den bedste tilgængelige behandlinger opnår kun en 50% healing sats, og dette er ofte midlertidig, ⁷ med recidiv satser så højt som 66% hos diabetikere. ^3,6 Når sår forekomme hos diabetespatienter, større komplikationer såsom infektion og amputation stige drastisk. Trods næsten et århundrede af omfattende forskning og udvikling af tusindvis af dressing produkter, har ingen endnu vist sig effektiv. Den erklæring om, at "Gamle sår i 1830 vil være de ældre sår i 1860," made ​​in en af de første papirer, der beskriver kronisk sår behandling, der stadig gælder i dag. ⁸ finde en egnet dyremodel for sår undersøgelse har været en stor udfordring for forskere, som såvel som for klinikere. Mange dyremodeller er blevet skabteller foreslået for sårpleje undersøgelse, men et sår model svarer til en kronisk, ikke-helende humant sår er ikke-eksisterende. ^9,10 Dette skyldes, at alle humane diabetiske sår har en kombination af vævsiskæmi, kronisk hyperglykæmi, oxidativt stress, neuropati og bakteriekolonisering. Iskæmi kan ikke være den tidligste årsag til diabetiske fodsår, men det er den væsentligste årsag til den fortsatte eksistens af disse sår, ^11. Dette skyldes sår ikke heler i væv, der ikke bløder, hvorimod de næsten altid helbrede i væv, der bløder udstrækning. ^12-15 Desværre har ingen af de for tiden anvendte dyre iskæmiske sår modeller er blevet anvendt med succes i diabetiske dyr, og dette har skabt en stor hindring for afprøvning af sår narkotika. Små kliniske forsøg med vækstfaktorer, såsom bFGF, har vist sig, at de er yderst effektive, men de er ineffektive til hypoxiske dermale sår modeller. ^16,17

Vi udgav en kunsticle 2007 beskriver en iskæmisk kaninøret sår model der blev anvendt med succes i diabetiske dyr. ^18. Teknikken er noget vanskelig at udføre, fordi en omhyggelig dissektion af den kraniale neurovaskulær bundtet er nødvendig. Fordi disse fartøjer er små, deres bidrag til den postoperative opsving er ubetydelig. Siden da, har vi forenklet procedure ved at skære hele kranie neurovaskulær bundt. At sammenligne med den procedure, hvor det kraniale bundtet var bevaret, var der ingen forskel i sårheling eller øre komplikationer. Denne modificerede minimalt invasiv procedure har følgende fordele: 1). Det er enkelt, sikkert, og har en høj succesrate, der reducerer smerte og lidelse for dyrene. Ingen kirurgisk komplikation er forekommet i disse dyr, herunder et par kaniner med 24 måneder diabetisk tid, 2). Det har en lang iskæmisk tid. Vores målinger viste en hud temperaturforskel ved udgangen af ​​en måned. Det er muligt at the omfattende subkutant væv dissektion uden at det kræver suturering af væv tilbage resulterer i forsinket kollateraldannelse; 3). Det er meget fleksibelt. Fordi de tre vaskulære bundter er alle under kirurgiske kontrol, kan det model let gøres til at efterligne forskellige kroniske sår (se nedenfor), 4). Modsætning til huden andre steder, har disse sår ikke hårsækkene i sårlejet. Helbredelsen er fuldstændig fra sårkanten, 5). Denne procedure skaber 4 iskæmiske sår og 4 ikke-iskæmiske sår i den samme kanin for parret sammenligning, hvorved variationer, 6). Hud sammentrækning er minimal. Mens den dorsale hud kaninøret har en mobilitet, er den ventrale huden immobiliseres ved brusk, hvilket tillader mere nøjagtig undersøgelse af re-epitelisering, ¹⁹ 7). Kaniner er generelt tilbageholdende og aggressiv. Anæstetika er kun nødvendigt i sårdannelse kirurgi. Dette kan reducere eventuelle forstyrrende faktorer, der kan påvirke sårhelingsprocesserne 8). Det er også very økonomisk, fordi op til 8 sår kan foretages i en kanin. 9). I modsætning til nogle tidligere rapporter, har vi ikke set nogen hypertrofisk ardannelse i enten ikke-diabetiske eller diabetisk kaniner observeret i mere end 24 måneder efter operationen. Mekanismen er stadig uklart.

Flere tiltag kan tages for at ændre driften til at opfylde forskellige prøvningskrav. 1). Yderligere forlængelse af iskæmisk tid. Vore nuværende resultater viser, at huden temperaturforskellen opretholdes i mindst en måned. Hvis nogle inert materiale (såsom silicone) anvendes til at fylde tunnelen, at udsætte kollateraldannelse kan iskæmisk forlænges. Forsøgte vi denne teknik i nogle kaniner og fundet meget få vævsreaktion, 2). Total øre denervering. Vores teknik skærer de nerver i de to vaskulære pedicles (Central-og craniale), forlader caudale gren intakt. Hvis totale sår denervering er nødvendig, kan den nerve gren i den caudale stilken også udskilles som vill, 3). Hvis såret bakteriel inokulation er nødvendig, kan den påføres på såret. Idet bunden af ​​såret er øret brusk, har potentialet til at blive infektion og perforering. At forhindre brusk komplikationer, bør bakteriel inokulering påføres efter brusk er dækket af granulationsvæv. Det skal bemærkes, at bakteriel kontaminering let fremstilles og kan udvide det væsentligt helingstiden. Men etablering af biofilm i akutte sår er vanskeligere. Ved hjælp af klinisk materiale og state-of-the-art teknologi, er biofilm vist sig at være etableret i kun 6% af akutte sår, mens der i kroniske sår forekomsten er ti gange højere (60%) ²⁰ Vores erfaringer har vist, at når diabetiske gange nå to år, kan de fleste af de sår på iskæmisk øret bliver smittet selv med streng aseptisk teknik. 4). Tryksår forekommer ofte hos patienter med central eller perifer nerveskade på grund af tab af følelse. Anvendelse af denne model, en trykfiltretre sår kan også skabes af forskellige komprimeringsmetoder. ^21,22

Materials

For monitoring during surgery

A heating pad to maintain normal temperature. A transcutaneous oxygen monitor. A temperature monitor.

For surgery

A #3 knife with #15 blade. Two pairs of forceps (one for skin and another for other soft tissues). 2-3 pairs of small clamps. One or two pairs of micro scissors (for tissue cutting). One pair of small scissors (for cutting sutures). A needle holder. A few stainless steel punches (for making wounds).