En förenklad teknik för framställning av en ischemisk sårmodell

Summary

Vi har utvecklat en minimalinvasiv teknik för att skapa en kanin ischemisk modell örat sår genom att dividera den centrala artär och nerv och den kraniala neurovaskulära bunten. En subkutan tunnel skär sedan alla subkutana vävnader. Detta förfarande orsakar minimal huden störningar och kan användas säkert med diabetes djur.

Abstract

En stort hinder i nuvarande diabetiker såret forskning är en brist på en ischemisk sår modell som kan användas säkert i diabetiska djur. Läkemedel som fungerar bra i icke-ischemiska sår kanske inte fungerar i mänskliga diabetiska sår eftersom vaskulopati är en viktig faktor som hindrar läkning av dessa sår. Vi publicerade en artikel i 2007 beskriver en kanin örat ischemisk sårmodell skapats av en minimalinvasiv kirurgisk teknik. Sedan dess har vi ytterligare förenklad förfarandet för enklare användning. På den ena örat, har tre små hud snitt görs på vaskulära pediklar, 1-2 cm från örat basen. Den centrala artären ligerades och skars längs med nerven. Hela kraniell bunten skars och ligerades, vilket innebär att endast den näst sista grenen intakt. En perifer subkutan tunnel gjordes genom snitt, att skära subkutan vävnad, muskler, nerver och små fartyg. Det andra örat har använts som ett icke-ischemisk kontroll. Fyra sår gjordes på den ventrala sidan of. varje öra. Denna teknik ger 4 ischemiska sår och 4 icke-ischemiska sår i ett djur för parade jämförelser. Efter operation var ischemiska örat sval och cyanotisk och visade minskad rörelse och en brist på puls i örat artären. Hudtemperatur av ischemisk örat var 1-10 ° C lägre än den normala örat och denna skillnad bibehölls under mer än en månad. Öronvävnad högenergifosfatkälla innehållet var lägre i den ischemiska örat än kontrollen örat. Sårläkande var längre i den ischemiska örat än i den icke-ischemiska örat när samma behandling användes. Tekniken har nu använts på mer än 80 kaniner i vilka 23 var diabetiska (diabetes tid som varierar från 2 veckor till 2 år). Ingen enskild kanin har utvecklat några kirurgiska komplikationer såsom blödning, infektion eller bristning i huden snitt. Modellen har många fördelar, såsom lite hud störningar, längre ischemisk tid och större framgång, jämfört med många andra modeller. Det can användas säkert på djur med nedsatt motståndskraft, och kan även modifieras för att möta olika testkrav.

Protocol

1. Anatomic Basis

Kaninen örat har varit ett gynnat studiematerial för sårvård sedan början av ^20-talet. Örat levereras av tre kärlknippena (central, kraniell och kaudalt), den centrala bunten är den största, medan fartyg i kraniala och kaudala buntar varierar i storlek. Ibland kan den näst sista artären vara frånvarande. ¹ Alla dessa fartyg lätt identifieras på ryggsidan när örat rakat (Fig. 1). På den ventrala sidan, tar emot den distala huden inte blodtillförsel från de proximala kärl. De tre fartyg buntar på rygg örat har många grenar som tränger igenom brosket att ge blodtillförseln till den distala ventrala huden (Fig. 2). I vissa kaniner, inträffar en mycket liten subkutan kärlet också på den ventrala sidan, som levererar blod till inte mer än 1/3 av den ventrala huden. I ett öppet omgivande hud snitt, det är essenligt någon blödning från en ventral snitt.

2. Kirurgisk procedur

1. Kanin vägs och öronen rakades, längs med baksidan av nacken.
2. En premedicinering av Buprenorfin (0,01 mg / kg) ges IM en timme innan operationen.
3. Anestesi induceras med en blandning av ketamin (50 mg / kg) och xylazin (5 mg / kg) IM.
4. Kaninen är skyddad med en värmedyna under kirurgi, ögonen skyddas med salva, och dess vitala övervakas under kirurgi.
5. Den kirurgiska fältet är beredd aseptiskt med en kirurgisk scrub och draperad så att de två öronen exponeras.
6. Ett öra återges ischemisk, medan det andra örat tjänar som en parad icke-ischemiska kontrollen.
7. De tre vaskulära pediklar identifieras genom artärer och vener.
8. Med hjälp av en # 15 blad, är tre små vertikala snitt (1-1,5 cm) gjorde på vaskulära pediklar, ca 1-2 cm från örat basen.
9. Den centrala venen ärisoleras från de omgivande vävnaderna och en sutur används för att omsluta den för indragning. Den centrala artären ligeras med 4-0 suturer och splittrad.
10. Den medföljande centrala nerven också kapas.
11. Hela kraniell BLOMSTJÄLK är ligeras och delas.
12. Den näst sista BLOMSTJÄLK bevaras.
13. En subkutan tunnel sker genom de 3 snitt. Detta uppnås genom trubbig dissektion med en klämma och skarpa dissektioner med en kniv och sax. Alla subkutana vävnader, muskler, nerver och små vaskulära grenar har upphört. De små vasculatures undertill dermis är helt delad. Alla de subkutana vävnaderna skärs till nivån av brosk med bladet.
14. Ytterligare skarpa och trubbigt dissektioner används för att rensa upp i basen, vilket ger en naken brosk ca 5-10 mm bred.
15. Denna procedur avbryter alla de subkutana vaskulära grenarna för att förhindra dem från att snabbt inrättande av säkerheter.
16. Blödningen ärminimala. Om det finns någon, kan den lätt kontrolleras genom gasväv kompression, utan behov av elektrokauterisation.
17. Huden inne i örat avger inte mycket blodtillförsel och därför inte anskäras.
18. De 3 hudincisionerna stängs med 4-0 eller 5-0 suturer, och täckt med steril gasbinda.
19. Förfarandet resulterar i 3 små hudincisionerna och ådrar sig mycket mindre hudskador än en öppen kirurgi.
20. Fyra cirkulära full tjocklek hudsår skapas på den ventrala sidan av varje öra med en 6-mm stansen av rostfritt stål. Avståndet mellan de sår är åtminstone 20-30 mm. Huden inuti stansen såret avlägsnas från brosk. Den perikondrium tas också bort, med hud eller separat. Den grund på vilken granulering och läkningen sker är brosket, men brosket inte är perforerad (Fig. 3).
21. När såren på båda öronen är fullbordad provning läkemedlet appliceras på ena sidan av två sår medan kontrollgruppen läkemedlet är applkopieras till såren på den andra sidan. Ett ocklusivt förband (Tegaderm, 3M) användes för att täcka såret. Detta hindrar sår från uttorkade bli.
22. Såren på bottendelen av örat läka normalt snabbare än sår på toppen av örat. För sårläkning jämförande studie, rekommenderas det att jämföra de två sår på ena sidan med två sår på andra sidan, eller för att jämföra de övre och nedre sår separat.

3. Postoperativ vård

1. En Duragesic lapp fäst på baksidan huden för att släppa Fentanyl (25 ug / timme) under 2-3 dagar för att minska risken för smärta.
2. Kaninerna får fri tillgång till mat och dryck.
3. Förbandsbyten utförs dagligen. De gamla förband avlägsnas och såren rengörs med sterila bomullstoppar. Digitala bilder tas för jämförelse. Nya förband tillämpas, och såren är täckta igen genom Tegaderm. Ingen bedövning behövs under klär chAnges.
4. Hudtemperatur mäts dagligen på vardera örat för jämförelse.
5. Ytterligare öra blodcirkulationen kan mätas med en transkutan syrespänning mätare eller en laser-Doppler flödesmätare.
6. Suturerna kan avlägsnas efter en vecka.
7. För icke-diabetiker djur, de flesta av de örat såren läker vanligen inom 2-3 veckor.

4. Komplikationer och hur man undviker dem

Denna minimalt invasiv kirurgi är säker och komplikationer är sällsynta. Med undantag för en övergångsperiod postoperativ milt örat ödem, ingen av våra kaniner har haft några svåra kirurgiska komplikationer. Det finns dock flera potentiella komplikationer för detta förfarande:

1. Blödning. Blödning kan uppstå i snitten om hemostas är ofullständig eller om ett större blodkärl (som en av de viktigaste BLOMSTJÄLK fartyg) är skadad. Detta är lätt undvikas genom försiktig dissektion. Förutom de tre stora vaskulära buntar, där enär många mindre subkutan vaskulära grenar. När subkutan tunnel görs, är dessa kärl skärs men ingen kopplande är nödvändig. Hemostas kan uppnås genom att helt enkelt gasväv att trycka på. Detta görs enkelt genom insättning av ett hörn av gasväv i tunneln under några minuter. Innan du stänger snittet, så att ingen aktiv blödning är närvarande.
2. Incision infektion och sårruptur: Dessa komplikationer kan uppstå om snitten är förorenade. Detta kan undvikas genom användning av strikt aseptisk teknik och ingen antibiotika behövs. Om emellertid infektion inträffar, lämplig dränering och förbandsbyten behövs.
3. Öronödem: På grund av vaskulära ligeringar och avbrott i lymfcirkulationen, kan lätt öronödem närvarande några dagar. Men försvinner den av sig själv och ingen behandling är nödvändig.

5. Representativa resultat

Sedan 2007 har vi använt detta förfarande i mer än 70 kaniner, inklusive 23 diabetisk enDJUR. I diabetiska gruppen var operation som utförts vid olika tidpunkter diabetes: sju kaniner hade två veckor diabetiker tid, hade fyra av dem två månader, tio hade 12 månader och 2 hade 24 månader diabetiker tid.

Omedelbart efter operationen, visade den ischemiska örat sval och cyanotisk, med mild ödem. Den viktigaste öronartären-den centrala artären, hade en stark puls i den normala öra, men denna puls inte var närvarande i den ischemiska örat. Ear rörelsen minskade, men inte helt försvinna. Huden visade tydliga fördjupningar över tunneln, men ingen ischemi eller nekros påträffades i något djur (Fig. 4).

Huden temperaturer de normala och ischemiska öronen mättes med en digital termometer (Omron av Omron Healthcare, Bannockburn, IL, eller en typ K infraröd plats termometer av Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Temperaturskillnaderna mellan den icke-ischemiska och ischemisk öra sträckte sig från 1 till 10 ° C, wed de flesta kaniner som faller inom området 2-6 ° C. Fig. 5 visar de genomsnittliga temperaturskillnader från 30 kaniner. Temperaturskillnaden var högre i de första dagarna efter operation, minskade gradvis efter dag 15, men var fortfarande hölls vid slutet av en månad.

Tissue högenergifosfatkälla innehållet mättes hos vissa djur efter att de avlivades. Sex vävnadsprover togs från varje öra och hög energi fosfat innehållet mättes med HPLC. Både ATP och totalhalter energi var högre i de normala öronen än i de ischemiska öronen. Figur. 6 visar ett exempel på en kanin avlivades 23 dagar efter kirurgi. De genomsnittliga vävnad ATP innehållet var 0,349 ± 0,047 pmol / g (medelvärde ± SD) i den normala örat vs 0,237 ± 0,059 pmol / g i den ischemiska örat (p <0,005). Betyda total energi (ATP + ADP + AMP) var 0,882 ± 0,137 pmol / g i den normala örat vs 0,556 ± 0,115 pmol / g i den ische MIC öra (p <0,001).

Sårläkande gånger var alltid längre tid för ischemisk örat än för det icke-ischemiska örat i alla grupper (icke-diabetiska eller diabetisk). Fig.. 7 visar en jämförelse av läkning mellan 26 paren av sår på ischemiska och icke ischemiska öron. Läkningstiden varierade från 13 till 18 dagar (i medeltal 14,9 ± 1,6 dagar) på de normala öronen vs 17 till 27 dagar (i medeltal 20,5 ± 3,4 dagar) på ischemiska öronen (p = 0,001). Sårläkande gånger i gamla och diabetisk kanin var mycket längre, särskilt när diabetes var mer än 12 månader.

I dessa kaniner är alla snitten läkta normalt utan några komplikationer, inklusive kaniner med 24 månader diabetiker tid. Figur 8 en histologi prov visar läkt subkutan tunnel i vilka muskler är frånvarande och ersätts av fibrösa vävnader. Dock är huden intakt.

/ 3341fig1.jpg "/>
Figur 1. Kaninörat matas genom tre vaskulära knippen. Den centrala är den största, är kraniell mindre och den näst sista bunten är den minsta. Dessa fartyg är lätt syns på ytan efter örat rakat.

Figur 2. De tre kärlet buntar på den dorsala örat tillför blod inte bara till den dorsala huden, utan även att den ventrala huden genom penetrerande kärl. Pilen visar de penetrerande kärl genom brosket. Den infällda bilden visar Tvärsnitt av dessa fartyg.

Figur 3. Fyra 6-mm sår skapas på den ventrala sidan av örat, och perikondrium avlägsnas också. Den grund på vilken granulering och läkningen sker är brosket, men brosket inte är perforerad. Det 3 smal l hud snitt stängs med mycket lite hud störningar.

Figur 4. Efter hudincisionerna är stängda, är fördjupningen över subkutan tunnel tydligt ses.

Figur 5. Den genomsnittliga hudtemperaturen skillnaden mellan det normala och ischemiska örat i 30 kaniner. De tidiga skillnaden ligger i intervallet från 7 ° C till 10 ° C efter kirurgi. Skillnaden minskar gradvis men fortfarande hölls vid slutet av en månad.

Figur 6. Öronvävnad högenergifosfatkälla innehållet reduceras i den ischemiska örat jämfört med icke-ischemiska örat vid 23 dagar efter kirurgi (p <0,001).

41/3341fig7.jpg "/>
Figur 7. Sårläkning är längre i de ischemiska öron än de icke-ischemiska öron (26 sår vardera). Läkning definieras som återställande av integriteten för skadad vävnad, dvs fullständig reepitelisering av sårställen.

Figur 8. Histologi prov visar den örondel som innehåller subkutan tunnel. Den läkte vävnaden är tunnare än normalt öra, är den ursprungliga skelettmuskel frånvarande och ersätts av fibrösa vävnader. Dock är huden intakt.

Discussion

Diabetes drabbar 23,6 miljoner människor i USA, ^2,3 och 15-20% av dessa patienter utvecklar fotsår under sin livstid, ^4,5 med en årlig behandlingskostnad på mer än $ 25 miljarder kronor. ^3,6 Men även den bästa tillgängliga behandlingar uppnår endast 50% healing takt och detta är ofta tillfälliga, ⁷ med återfall priser så höga som 66% hos diabetiker. ^3,6 Vid sår förekomma hos patienter med diabetes, större komplikationer såsom infektion och amputation öka dramatiskt. Trots nästan ett sekel av omfattande forskning och utveckling av tusentals dressing produkter har ingen visat men effektiv. Påståendet att "Gamla sår i 1830 kommer att vara de äldre sår i 1860," made ​​in en av de första tidningarna som beskriver kronisk sårbehandling fortfarande gäller idag. ⁸ hitta en lämplig djurmodell för sår studie har varit en stor utmaning för forskare som samt för kliniker. Många djurmodeller har skapatseller föreslås för sårvård studie, men ett sår modell kan jämföras med en kronisk, icke-läkande människa sår är obefintlig. ^9,10 Detta beror på att alla mänskliga diabetiska sår har en kombination av vävnadsischemi, kronisk hyperglykemi, oxidativ stress, neuropati och bakteriell kolonisering. Ischemi kan inte vara den tidigaste orsaken diabetiska fotsår, men det är den främsta orsaken till att det fortfarande finns dessa sår, ^11. Detta beror på att såren inte läker i vävnad som inte blöder, medan de nästan alltid läka vävnad som blöder mycket. ^12-15 Tyvärr har ingen av de närvarande används djurförsök ischemiska sår modellerna ännu inte använts framgångsrikt i diabetiska djur, och detta har skapat ett stort hinder för testning av sår läkemedel. Småskaliga kliniska prövningar av tillväxtfaktorer, såsom bFGF, har visat att de är mycket effektiva, men de är ineffektiva i hypoxiska hudsår modeller. ^16,17

Vi publicerade en konsticle i 2007 beskriver en ischemisk kaninmodell öra sår som användes framgångsrikt i diabetiska djur. ^18. Tekniken är något svårt att utföra eftersom en noggrann dissektion av den kraniala neurovaskulära knippet behövs. Eftersom dessa fartyg är små, är deras bidrag till den postoperativa återhämtningen försumbar. Sedan dess har vi förenklat förfarande genom att skära hela kraniala neurovaskulära bunt. För att jämföra med förfarandet i vilket hjärn bunten bevarades fanns ingen skillnad i sårläkning eller komplikationer öra. Denna modifierade minimalt invasiv förfarande har följande fördelar: 1). Det är enkelt, säkert, och har en hög träffsäkerhet, vilket minskar smärta och lidande för djuren. Ingen kirurgisk komplikation har inträffat i dessa djur, däribland några kaniner med 24 månaders diabetiker tid, 2). Den har en lång ischemisk tid. Våra mätningar indikerade en skillnad hudtemperaturen vid slutet av en månad. Det är möjligt att tee omfattande subkutana vävnaden dissektion utan att kräva suturering resultaten vävnad tillbaka i försenad säkerhet formation, 3). Det är mycket flexibelt. Eftersom de tre vaskulära knippen är alla under kirurgisk kontroll, kan denna modell lätt göras för att efterlikna olika kroniska sår (se nedan), 4). Till skillnad från huden på andra platser, dessa sår har inga hårfollikel i sårbädden. Läkningen är helt från sårkanten, 5). Detta förfarande skapar 4 ischemiska sår och 4 icke-ischemiska sår i samma kanin för parad jämförelse, varigenom individuella variationer, 6). Hud kontraktion är minimal. Medan den dorsala huden av kaninöra har viss rörlighet i den ventrala huden splinted genom brosk, vilket tillåter mer noggrann undersökning av återepitelisering, ¹⁹ 7). Kaniner är i allmänhet blyga och icke aggressivt. Anestetika behövs endast under sårande kirurgi. Detta kan minska eventuella felkällor som kan påverka processerna sårläkning, 8). Det är också very ekonomiskt eftersom upp till 8 sår kan göras i en kanin. 9). I motsats till vissa tidigare rapporter har vi inte sett något hypertrofisk ärrbildning i antingen icke-diabetiker eller diabetiker kaniner observerats under mer än 24 månader efter operationen. Mekanismen är fortfarande oklart.

Flera metoder kan vidtas för att ändra den för att möta olika testkrav. 1). Ytterligare förlängning av ischemisk tid. Våra nuvarande resultat visar att huden temperaturskillnaden bibehålls åtminstone en månad. Om några inerta material (såsom silikon) används för att fylla i tunneln för att fördröja bildning säkerhet kan ischemisk förlängas. Vi försökte denna teknik i vissa kaniner och hittade väldigt lite vävnadsreaktion, 2). Total öra denervering. Vår teknik klipper nerverna i de två vaskulära pediklar (Central-och kraniala), lämnar den näst sista grenen intakt. Om den totala såret denervering behövs kan nerven gren i den näst sista BLOMSTJÄLK också avskiljas som vill, 3). Om såret bakteriell inokulering behövs, kan den appliceras på såret. Eftersom basen av såret är örat brosk, har det potential att få infektionen och perforering. För att förhindra brosk komplikationer, bör bakteriell ympning tillämpas efter brosket är täckt av granulationsvävnad. Det bör noteras att bakteriekontamination lätt tillverkas och det kan signifikant förlänga läkningstiden. Emellertid är inrättandet av biofilmen i akuta sår svårare. Med kliniskt material och state-of-the-art teknik, har biofilm visats vara etablerat i endast 6% av akuta sår, medan kroniska sår förekomsten är tio gånger högre (60%), ²⁰ Vår erfarenhet har visat att när diabetes gånger till två år, kan de flesta sår på den ischemiska örat smittas även med strikt aseptisk teknik. 4). Trycksår ​​uppstår ofta hos patienter med central eller perifer nervskada till följd av nedsatt känsel. Med användning av denna modell, en tryckledninRe magsår kan också skapas genom olika komprimeringsmetoder. ^21,22

Materials

For monitoring during surgery

A heating pad to maintain normal temperature. A transcutaneous oxygen monitor. A temperature monitor.

For surgery

A #3 knife with #15 blade. Two pairs of forceps (one for skin and another for other soft tissues). 2-3 pairs of small clamps. One or two pairs of micro scissors (for tissue cutting). One pair of small scissors (for cutting sutures). A needle holder. A few stainless steel punches (for making wounds).