Summary
هذه المخطوطة تصف ثلاثة بروتوكولات مكملة لتقييم سمية polyglutamine (polyQ) التوسع البروتينات في الخميرة
Abstract
ويرتبط مع بروتين misfolding العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، وخاصة أمراض الاعصاب، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ومرض هنتنغتون 1. ويتسبب مرض هنتنغتون (HD) من قبل توسع غير طبيعي في منطقة (polyQ) polyglutamine داخل huntingtin بروتين. البروتين huntingtin polyQ-الموسع يبلغ 1 التشكل الشاذة (أي أنه misfolds) ويسبب السمية الخلوية 2. هي سبب لا يقل عن ثمانية أمراض الاعصاب المزيد من polyQ-التوسعات، بما في ذلك الترنحات السبيل النخاعي، ومرض كنيدي 3.
سهلت الخميرة كائن حي نموذج رؤى هامة في أساس الخلوية والجزيئية من polyQ سمية، بما في ذلك أثر العوامل داخل وفيما بين الجزيئية من polyQ سمية، وتحديد مسارات الخلوية التي يعانون من ضعف في الخلايا معربا عن polyQ التوسع البروتينات 3-8. مهملاي، استنسخت العديد من جوانب polyQ سمية التي وجدت في الخميرة في النظم التجريبية الأخرى، وإلى حد ما في عينات من المرضى HD، مما يدل على أهمية نموذج الخميرة لاكتشاف الآليات الأساسية التي تقوم عليها polyQ سمية.
وهناك طريقة مباشرة وبسيطة نسبيا لتحديد polyQ سمية في الخميرة هو قياس العيوب نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. هذا المخطوط يصف ثلاثة نهج التجريبية التكميلية لتحديد polyQ سمية في الخميرة عن طريق قياس نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. أول نهجين التجريبية مراقبة نمو الخميرة على لوحات، ونهج ثالث يراقب نمو الثقافات الخميرة السائلة باستخدام أداة BioscreenC.
وعلاوة على ذلك، هذا المخطوط يصف الصعوبات التجريبية التي يمكن أن تحدث عند التعامل مع نماذج polyQ الخميرة ويحدد الاستراتيجيات التي من شأنها أن تساعد على تجنب أوتقليل هذه الصعوبات. ويمكن استخدام البروتوكولات وصفها هنا من أجل تحديد وتوصيف مسارات الوراثية والجزيئات الصغيرة التي تعدل polyQ سمية. وعلاوة على ذلك، قد وصف المقايسات بمثابة نماذج للتحليل الدقيق للتسمم الناجم عن مرض البروتينات المرتبطة أخرى تتجمع في نماذج الخميرة.
Protocol
1. التعبير عن البروتينات PolyQ التوسع السمية في الخميرة
وقد أنشأت إجراء تحليل منهجي دقيق لتسلسل الأحماض الأمينية للبروتين polyQ التوسع المطلوب لإنتاج سمية في خميرة 7. هذا السامة polyQ التوسع يحتوي على بروتين الأميني محطة العلم العلامة تليها 17 من الأحماض الأمينية تسلسل الأصلي للبروتين huntingtin، وهي منطقة polyQ، والانصهار كربوكسي لمحطة لبروتين فلوري (إما GFP أو الحراجية المعتمدة، انظر الشكل 1 أ). التعبير عن البروتينات مع التوسعات polyQ من 46 glutamines أو أكثر (على سبيل المثال 72 و 103 glutamines) وتنتج سمية في الخميرة عندما أعرب تحت سيطرة محرض والنسبية قوي GAL1 المروج 7 و 9.
كما هو موضح سابقا، polyQ سمية في الخميرة واضح فقط في الخلايا التي تحمل Rnq1p بروتين بريون في التشكل لها، [RNQ +]، على سبيل المثال السلالة خميرة W303 9. والسامة ص بروتين polyQ التوسعecapitulates الجوانب المركزية للpolyQ البيولوجيا في الخميرة، مثل سمية التي تعتمد على طول polyQ (انظر أدناه)، وتجميع (الشكل 1 ب). والجدير بالذكر أن سمية polyQ التوسع البروتينات لا تقتل خلايا الخميرة على الفور، بل يضعف أو بالأحرى إلقاء القبض على دورة الخلية وdevision الخلية، وبالتالي تباطؤ أسفل أو تثبيط نمو مستعمرات الخميرة على لوحات أو الثقافات السائل (البيانات المتوفرة لدينا غير منشورة).
2. المشاكل المحتملة مع خلايا الخميرة تعرب عن السامة PolyQ التوسع البروتينات
قد خلايا الخميرة معربا عن توسيع غير ذلك من البروتينات السامة polyQ لا تظهر أي عيب نمو 9. الطبيعة الجينية لهذه المكثفات من polyQ سمية لا يبدو أن يستند إلى الطفرات مندلية بسيطة، وبالتالي يمكن أن تحدث مع وتيرة عالية نسبيا (نتائجنا غير منشورة). ونحن التكهن التي هي سبب هذه المكثفات عفوية من قبل مجهولين علاج من البريونات التي تعمل على غرار [RNQ +] في تحديد toxicity.Thes polyQيمكن المكثفات عفوية (ه) من سمية polyQ يعرض للخطر نجاح أي تجربة والتي تهدف إلى تميز polyQ سمية أو لتحديد وتوصيف معدلات السمية polyQ.
من أجل تجنب تكرار وقوع هذه المكثفات عفوية، اتباع التدابير الوقائية المبينة أدناه، والتي ثبت أنها فعالة للغاية:
- استخدام خلايا الخميرة الطازجة للتجارب سمية. لا تقم بتخزين خميرة لفترات طويلة من الزمن. استرداد كثيرا مستعمرات الخميرة الطازجة من المخزونات المجمدة.
- رصد في كثير من الأحيان التعبير وتجميع البروتينات polyQ التوسع السامة عن طريق الفحص المجهري مضان.
- الحفاظ على خلايا الخميرة في وسائل الإعلام التي تقمع التعبير عن سمية polyQ السامة في جميع الأوقات (أي في وسائل الإعلام التي تحتوي على انتقائية الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون) قبل البدء في أي قياسات سمية.
- تستخدم ثلاثة على الأقل transformants مستقل لكل تجربة polyQ سمية. </ لى>
3. نمو فحوصات
- لكل حالة تجريبية، تطعيم كل مستعمرة واحدة من ثلاث transformants مستقل من خلايا الخميرة إيواء السامة polyQ التوسع بروتين في 3 مل من وسائل الاعلام خميرة انتقائي مع الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون.
- احتضان هذه الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في ظل هذه الظروف، فإن الخلايا لا يتم التعبير عن بروتين polyQ التوسع لأن الجلوكوز في المتوسط يقمع التعبير عنها. لا تدع هذه اكتسى الثقافات؛ الحفاظ على OD 600 (امتصاص الضوء من طول موجي نانومتر 600) من الثقافات بين عشية وضحاها إلى أقل من 1.
- نحن نستخدم بشكل روتيني 3 فحوصات مختلفة لرصد عيوب نمو خلايا الخميرة معربا عن السامة polyQ التوسع بروتين:
3.1 نمو على لوحات
- تمييع الثقافات خميرة بين عشية وضحاها (نمت مع الهز دورة في الدقيقة 220) إلى OD 600 من 0.0005 (أي تخفيف 1:1000 ثقافة OD600 0.5 =) في انتقائية ليديا 7 تحتوي على جلوكوز.
- موزعة بالتساوي 50 ميكروليتر (الناتجة في كاليفورنيا. 700 المستعمرات في لوحة) من كل ثقافة المخفف على واحد لوحة (10 قطرها سم) مع متوسط الانتقائية التي تحتوي على الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون واحدة مع لوحة متوسطة الانتقائية التي تحتوي على اللبن كمصدر وحيد للكربون.
- احتضان لوحات لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 30 درجة مئوية. بعد الحضانة، والتقاط صور فوتوغرافية من كل لوحة، وحساب عدد المستعمرات على جلوكوز وعدد من المستعمرات على لوحات الجالاكتوز. في ظل الظروف المثالية، ينبغي أن يكون هناك مستعمرات أو فقط عدد قليل جدا على لوحة الجالاكتوز عند استخدام خلايا الخميرة تعبر عن شديد السمية polyQ التوسع البروتين (103Q، الشكل 2A).
3.2 المقايسات الإكتشاف
هذا الفحص هو أكثر كمية من فحص الطلاء المذكورة أعلاه، وبالتالي يمكن أن تكشف عن خلافات خفية حتى في سمية polyQ مع نفس التجربة على نفس الصفيحة.
- تمييع overnالثقافات ight نمت في المتوسط مع الجلوكوز إلى OD 600 من 0.1.
- ماصة 200 ميكرولتر من هذه الثقافات المخفف إلى لوحات 96-جيدا العقيمة، وإعداد 5 التخفيفات المسلسل أكثر من خمس مرات في الماء المعقم باستخدام ماصة متعدد القنوات.
- باستخدام FROGGER، (وتسمى أيضا نصاب، وامتناع 8 دبابيس 6 × لنقل تعليق خلية) نقل تعليق الخلية التي تحتوي على لوحات وسائل الإعلام الانتقائي مع الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون واللوحات التي تحتوي على وسائل الإعلام الانتقائي مع اللبن كمصدر وحيد للكربون.
- السماح لوحات لتجف قبل تفرخ لهم في 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أو أربعة أيام.
- بعد الحضانة، والتقاط صور فوتوغرافية من كل لوحة (الشكل 2B).
3.3. مراقبة polyQ سمية في الخميرة بواسطة نمو الثقافات السائل
هذا البروتوكول هو الأكثر كمية (OD600 أرقام) من المقايسات الثلاثة المذكورة هنا، ويمكن الكشف عن وجود اختلافات دقيقة للغاية في السمية polyQ. وOC المذكورة آنفاcurrence من المكثفات عفوية، ولكن، يمكن ان تنتج يحتمل أن تكون النتائج مضللة. ولذلك فإنني أوصي الجمع بين هذا الاختبار مع ما لا يقل عن واحد من المقايسات تصفيح 2 المذكورة أعلاه. نقترح استخدام أداة BioscreenC لهذه التجارب. وBioscreenC أداة تقيس تلقائيا الكثافة البصرية للثقافات الخميرة في 100-جيدا لوحات في حين حضنت في درجة حرارة محددة مع الإثارة محددة. قد طرق أخرى لنمو خلايا الخميرة وقياس كثافتها الضوئية تنطبق أيضا.
- غسل خلايا الخميرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على الحد الأدنى من الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون ثلاث مرات في 3 مل من الماء المعقم.
- تمييع الثقافات بين عشية وضحاها نمت في المتوسط مع الجالاكتوز إلى OD 600 من 0.1.
- ملء كل بئر من لوحة 100 BioscreenC جيدا مع 300 ميكرولتر من الثقافات الخميرة.
- فتح برنامج سهل تجربة Bioscreen. تحديد عدد العينات التي ترغب في مراقبة (بما في ذلك الفراغات والمتوسطة فقط،وضع ضوابط)، ودرجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، وتعيين طول تجارب لمدة 3 أيام، تعيين فترات القياس إلى 15 دقيقة، تعيين عامل التصفية إلى 600 نيوتن متر / براون، وتعيين الوضع اهتزاز إلى 15 ثانية قبل كل قياس في متوسطة القوة.
- والصك BioscreenC والبرمجيات المرفقة إنتاج جداول البيانات إكسل من كل نقطة من نقاط البيانات التي اتخذت خلال هذه التجربة.
- إعداد منحنيات النمو مع Excel لكل عينة ومقارنة نمو عينات مختلفة (الشكل 2C). وقدمت وصفا مفصلا لتحليل البيانات التي تنتجها التجارب BioscreenC قبل 10.
4. ممثل النتائج
الشكل 1. نموذج الخميرة polyQ. أ) تمثيل تخطيطي للالسامة polyQ التوسع ب. البروتين) مضان المجهري تظهر خلايا الخميرة تعبير قصيرة، وغير سامة polyQبروتين توسع (25Q، لوحة على اليسار) وخميرة خلايا تعبر عن والسامة طويل polyQ التوسع البروتين (103Q، لوحة على اليمين).
الشكل 2. ممثل نتائج فحوصات نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. أ) انتشرت فحص التصفيحات. خلايا الخميرة ما يقرب من 700 على لوحات وحضنت لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية. لوحة العلوي يعرض لوحة تحتوي على نسبة الجلوكوز في المتوسط، أي التعبير عن بروتين polyQ التوسع السامة (103Q) لا يسببها. اللوحة السفلى تظهر لوحة تحتوي على خميرة اللبن المتوسطة، أي التعبير عن بروتين polyQ التوسع السامة هو فعل. حدث لا القامع عفوية لاحظ أن في هذه التجربة هو موضح هنا،. ب) الإكتشاف فحص. خمسة المسلسل خمسة أضعاف التخفيفات من خلايا الخميرة ايواء إما بروتين polyQ غير سامة (25Q) أو البروتينات السامة polyQ التوسعوقد شوهدت N (103Q) على لوحات الجلوكوز التي تقمع التعبير عن البروتينات (لوحة على اليسار) أو على لوحات الجلاكتوز التي تحفز على التعبير عنها. وحضنت ثم لوحات لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية ج) BioscreenC التجربة. تم رصد نمو الثقافات من التعبير عن خلايا الخميرة إما بروتين polyQ غير سامة (25Q) أو السامة polyQ التوسع البروتين (103Q) من قبل BioscreenC الصك. ووصف الظروف التجريبية وتحليل التجارب BioscreenC في النص الرئيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا المخطوط الضوء على ثلاث النهج التجريبي مكملة لقياس polyQ سمية في نموذج الخميرة كائن حي استنادا إلى انخفاض النمو من خلايا الخميرة معربا عن السامة polyQ التوسع البروتينات. وعرضت العمل في خميرة رؤى عميقة في آليات الأساسية الخلوية والجزيئية من misfolding البروتين وسميتها التي تلت ذلك، بما في ذلك misfolding وسمية polyQ التوسع البروتينات 9،11،12. وقد ساعدت التجارب على أساس البروتوكولات المعروضة هنا بالفعل إلى القدرة على تحديد وتوصيف وراثية أو المكثفات من سمية polyQ، معدلات جزيء صغير من سمية polyQ، والآليات الخلوية التي تقوم عليها polyQ سمية 5-8،13،14.
ويمكن بسهولة البروتوكولات المعروضة يمكن تكييفها لاستكشاف معدلات أخرى من سمية polyQ مثل ظروف النمو المختلفة أو الطفرات الوراثية التي تقلل أو تزيد من تفاقم سمية polyQ. علاوة على ذلك، قدم بروتوكول تجريبييمكن بسهولة تعديل لاختبار سمية من غيرها من البروتينات تتجمع السامة في الخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم العمل في المختبر Duennwald من المنح المقدمة من الاتحاد الأميركي للبحوث الشيخوخة (عفر)، ومؤسسة مرض وراثي (اتش دي اف) ومؤسسة وليام وود.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
References
- Soto, C., Estrada, L. D.
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T.
- Meriin, A. B. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).
- Duennwald, M. L., Lindquist, S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).
- Meriin, A. B. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells. J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).
- Gitler, A. D. Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Giorgini, F., Muchowski, P. J. Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast. Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).
- Ehrnhoefer, D. E. Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models. Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).
