Summary
Прямым набором методов, чтобы изолировать и определить личность из самых распространенных белков выражается в скелетных мышцах. Около 800 пятна различимы на двумерный гель от 10 мг мышц, что позволяет для определения гендерной экспрессии белка. Эти методы дают эквивалентные результаты в большинстве тканей.
Abstract
Валовой сокращение скелетных мышц определяется в первую очередь относительно небольшое количество сократительных белков, однако эта ткань также замечательно адаптироваться к факторам окружающей среды 1, таких как гипертрофия посредством упражнений сопротивление и атрофии путем употребления. Тем самым она экспонатов модернизации и адаптации к стрессовым факторам (жара, ишемия, тяжелые металлы, и т.д..) 2,3. Повреждение может произойти в мышцы мышцы оказывают силы в то время как удлинение, так называемые 4 эксцентричный сокращения. Сократительных белков могут быть повреждены в таких усилий и нуждается в ремонте, деградированных и / или resynthesized; эти функции не являются частью сократительных белков, но и другие, гораздо менее обильными белков в клетке. Чтобы определить, какие подмножества белков принимает участие в улучшении этого типа повреждения, глобальные протеома должны быть установлены перед тренировкой 5, а затем следуют после упражнений, чтобы определить дифференциальныеэкспрессии белка и тем самым подчеркнуть кандидата белков в адаптации к повреждениям и его ремонт. Кроме того, большинство исследований скелетных мышц были проведены на самец вида и, следовательно, не может быть представителем женского пола мышцы.
В этой статье мы представляем метод для извлечения белков воспроизводимо от мужских и женских мышц, и отделяя их от двумерного гель-электрофореза следуют высоким разрешением цифрового изображения 6. Это обеспечивает протокол для пятен (и впоследствии определены белки), которые показывают статистически значимыми (р <0,05) два раза увеличиваться или уменьшаться, появляться и исчезать из-под контроля государства. Затем они вырезали, перевариваются трипсином и разделенных высокоэффективной жидкостной хроматографии связаны с масс-спектрометром (LC / MS) для идентификации белков (LC / MS / MS) 5. Эта методика (рис. 1) может быть использован на многих тканях с практически никаких изменений (печень, мозг, услышатьт т.д..).
Protocol
1. Пробоподготовка
- Используйте свежие, флэш-замороженные или RNAlater обработанных тканей мышей в качестве исходного материала. Пятно от любой избыток консервантов с Kimwipe прежде чем продолжить.
- Удалите все сухожилия и фасции вокруг мышц и фарш ткани с одним краем лезвия в течение 2 минут на охлажденные стеклянные пластины в холодной комнате (4 ° C), пока ткань хорошо измельченного или мучнистый. Сбор образца в предварительно взвешенные микроцентрифужную трубки и определить вес ткани. Используйте не более 10 мг ткани вашего исходного материала.
- Добавьте 45 мкл буфера экстракции (8 М мочевины, 50 мМ DTT, 4% CHAPS, 0,2% амфолитов перевозчика 5 / 8, 0,0002% бромфенола синий) на 1 мг измельченной ткани, при комнатной температуре. Если объем больше 350 мкл, 350 мкл добавить первоначально и гомогенизации (шаг 1,4), затем добавить остальные буфера, чтобы минимизировать брызг.
- Однородный ткани в семь раз с моторизованным пестиком (Kontes Corp) в течение 15 секунд4 ° C, с двух минут охлаждение на льду между гомогенизации.
- Центрифуга образцов при 15 600 мкг в течение 30 минут при 4 ° C. Сохранить супернатант и измерить ее объем. Клетка мусора гранул отбрасывается.
- Осадок белка в надосадочной ледяной реагента класса ацетона (3 раза V: соотношение). Вихревые трубы в течение 15 секунд. Центрифуга для 15 600 мкг в течение 10 секунд в форме гранул, и ресуспендируют в добыче буфера с Kontes двигателя и полипропилена помешивая стержней (BioSpec Prod)
- Повторите шаг 1.6.
- Либо продолжить концентрации белка оценка образцов или хранить их при температуре -20 ° C.
2. Оценка Концентрация белка
Использование анализа Лоури 7 или анализа BCA 8 (Pierce); цель около 4,5 мг мл -1.
3. Изоэлектрическое фокусирование
- Удалить ReadyStrip полосы IPG (11 см, рН 5-8, Bio-Rad)от -20 ° С и дайте ему равновесие при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
- Vortex образца и пипетки 600-800 мкг (общий объем 200 мкл) белка образца в прямой линии на задней стороне канала в лоток регидратации образец, оставляя около 1 см с каждой стороны.
- Использование щипцов, снимите пластмассовую крышку IPG полоса - убедитесь, что работать только с конца полосы и избегать любого контакта с гелем. Обратите внимание на основные конце полосы и поместите его на левой стороне лотка. Место IPG полосы геля стороной вниз в верхней части образца, избежать захвата пузырьков под ним. Позвольте ему увлажняет в течение одного часа.
- Наложение с 2,5 мл минерального масла (BioRad). Крышка лотка с крышкой, и оставьте увлажняет ночь при комнатной температуре.
- Место бумаги фитиль на обоих концах канала фокусировки лоток и мокрого каждый по 10 мкл воды Millipore.
- Выньте IPG полосы и удерживать вертикально в течение приблизительно 10 секунд слить масло. Пятно пластиковые бс использованием ACK Kimwipe.
- Место IPG стороны гель раздеться и с основными конец оставил в фокусировка лоток. Обложка полосы с 2,5 мл минерального масла.
- Место лоток в клетку Protean МЭФ (Bio-Rad) и программа 3-х ступенчатый протокол (табл. 1) в ячейки по умолчанию температуре 20 ° С, максимальный ток 50 мкА / полосы, и не регидратации время.
Напряжение Время Вольт-Hrs Ramp Шаг 1 250 20 мин Линейный Шаг 2 8000 2,5 часа Линейный Шаг 3 8000 40000 Быстрый Общий 6,5 часа 40000 Таблица 1. Три шага протокола клеточных Protean МЭФ в течение 11 см IPG полосы.
- Возьмите IPG полосы из МЭФ ячейку с помощью щипцов. Пятно пластиковой подложке Kimwipe и место IPG стороне полосы геля в чистой лоток регидратации. Вы можете покрыть регидратации лоток и оберните ее полиэтиленовой пленкой и храните при температуре - 80 ° С или продолжить.
4. SDS полиакриламидном геле
- Передача полосы (до гель стороны) в 11 см лоток равновесия.
- Добавить 4 мл сокращение буфера (6 М мочевина, 2% SDS, 0,05 М Трис / HCl рН 8,8, 20% глицерина, 2% DTT) в канал и равновесие полосы в течение 10 мин с легким встряхиванием.
- Удалить сокращение буфера, добавляют 4 мл буфера алкилирования (6 М мочевина, 2% SDS, 0,05 М Трис / HCl рН 8,8, 20% глицерина, 2,5% iodoacetamide) и равновесие полосы в течение 10 минут с легким встряхиванием.
- Промыть IPG полосы путем погружения стрир кратко в 1 X SDS работает буфера (25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, рН 8,2).
- Положите стороне полосы геля вверх на заднюю панель 11 см Критерий сборных 10,5% -14% Трис-HCl SDS полиакриламидном геле (Bio-Rad) и нажмите на него нежно, так что она делает полный контакт с SDS гель; убедитесь в отсутствии пузырьков между двумя поверхностями геля.
- Наложение IPG полосы с 1 мл раствора в расплаве агарозы (0,5% агарозы, 25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, бромфенола синий), и пусть агарозном укрепить в течение 5 минут.
- Нагрузка 5 мкл белка маркера 10-225 кДа (USB, P / N: 76740) в одном и молекулярные стандарты веса.
- Запуск геля в SDS буфера (25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, рН 8,2) при 200 В при комнатной температуре или в холодной комнате (4 ° С) с использованием бромфенола синий миграции красителя перед следить электрофореза.
- Удаление геля из пластиковых литых и пятна ночь, встряхивая осторожно Кумасси бриллиантовый синийР-250 пятно (45,5% метанола, 45,5% dH2O, 9,0% раствором уксусной кислоты, 0,25% Кумасси Brilliant Blue R-250).
- Встряхните геля в Destain 1 решение (45,5% метанола, 45,5% дН 2 O, 9,0% уксусной кислоты) два раза в течение 3 часов и в Destain 2 (5% метанола, 90% дН 2 O, 5% раствором уксусной кислоты) в течение ночи. Храните гель в 7% уксусной кислоты для анализа.
5. Гель визуализации и анализа
- Захват изображений с использованием гелей Количество Один программа, которая работает VersaDoc визуализации системы (BioRad). Crop участки изображения, равномерно для всех гелей в эксперименте.
- Нагрузка обрезать изображения на PDQuest 8,0 программного обеспечения для создания эксперимента набор. Следуйте указаниям мастера установки эксперимента для определения параметров для выявления пятна и место соответствие между гелями. Осмотрите и уточнить место соответствующие результаты вручную, если это необходимо.
- Выполните количественный и статистический анализ гели для обнаружения пятна соответствуют белка с TWо-пас или выше статистически значимых различий в выражении между двумя группами геля. Создать анализа набора с этими пятнами интерес и вырежьте их использованием фрезы EXQuest месте (BioRad) для трипсин пищеварение и LC-MS основе идентификации белков.
6. В-гель триптического пищеварения
Для этого шага изменение Пирс В-гель Триптический Дайджест Kit (# 89871X, Пирс) протокол используется.
- Добавить 200 мкл destaining раствор (25 мМ бикарбоната аммония, 50% ацетонитрил), чтобы гель пробки. Vortex и инкубировать образцов при 37 ° С в течение 30 минут при встряхивании. Осторожно снимите и выбросьте решение.
- Повторите шаг 6.1.
- Добавить 30 мкл свежеприготовленного снижения буфера (50 мМ трис [2-карбоксиэтил] фосфин, 22,5 мМ бикарбонат аммония) в пробирки, содержащие гель пробками и инкубировать при температуре 60 ° С в течение 10 минут.
- Разрешить образцы, чтобы охладиться, а затем удалите и откажитесь от снижения буфера.
- Добавить 30 мкл алкилирования буфера (100 мМ iodoacetamide, 20 мМ бикарбоната аммония, готовят непосредственно перед применением в фольгу завернуты труб. Инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Удаляют алкилирования буфера. Вымойте гель пробки, добавив 200 мкл destaining решение в каждую пробирку. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 15 минут.
- Удаляют destaining и повторите мыться.
- Добавить 50 мкл ацетонитрила, чтобы гель пробками и инкубировать их в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы они могли сжиматься сухой, затем осторожно удалите ацетонитрила.
- Повторите шаг 6,8 раза больше. Гель части должен выглядеть белыми и малых.
- Разрешить гель куски сухой концентратор Centrivap (Labconco, модель EX1245) в течение 10 минут.
- Swell гель частей путем добавления 10 мкл активированного раствора трипсина (10 нг / мкл трипсина, 25 мМ бикарбоната аммония). Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мinutes.
- Добавьте 25 мкл буфера пищеварения (25 мМ бикарбоната аммония) для труб. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение ночи при встряхивании.
- Разрушать ультразвуком образцов в течение 10 минут (Брэнсон, ванна sonicator модель 2510) и спина их, прежде чем снимать супернатант в новую пробирку. Сохранить супернатант.
- Для дальнейшего извлечения пептидов, добавить 10 мкл 0,1% муравьиной кислоты и инкубировать 5 минут при комнатной температуре при встряхивании. Разрушать ультразвуком образцов в течение 10 минут, собирают супернатант и комбинировать с сохраненными супернатант в шаге 6.13.
7. Микромасштабные обессоливания пептидных экстрактов
- Удалить бикарбонат аммония и других солей в пептидных экстрактов с помощью PepClean С-18 Спиновые Столбцы (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя.
- Элюции пептидов в два раза с 20 мкл 70% ацетонитрил, испаряются образцы сухих путем центрифугирования в Centrivap Концентратор в течение 1 часа и ресуспендируйтепептидов в 10 мкл 0,1% муравьиной кислоты для анализа рассеянного склероза.
8. Белки идентификация ВЭЖХ связью масс-спектрометрии
- Отдельные 5 мкл пептида смесь на высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в течение 40 минут, используя линейные 2-50% градиентом ацетонитрила с 0,2% муравьиной кислоты на Pepswift монолитных PS-DVB колонке (Dionex) в сочетании с Nanospray я источника на масс-спектрометре ионной ловушки (LCQ Дека XP Max, Thermo Fisher Scientific) при скорости потока 400 л / мин на конце.
- Обнаружение пептид MS1 сигналы в диапазоне от 400 - 1400 т / г и позволяют три наиболее интенсивных ионных пиков быть изолированы для MS2 секвенирования по CID с динамическим исключения.
- Для идентификации белков, анализ результатов с помощью пептидных ссылкой Sequest мыши базу данных поиска (BioWorks программного обеспечения, Thermo Fisher Scientific-) со статическими алкилированные модификации цистеина и динамической модификации для фосфорилирования (серин, треонин, тирозин), methylaуравнения (гистидин), окисления (метионин), АДФ-рибозилирование (аргинин), а N-терминал ацетилирования. Применение консервативных условий соответствия (например, пептид толерантности установлен в 2 САМ и 1,00 фрагмент терпимости, белки содержат по крайней мере 2 пептидов проходящего Xcorr против зарядового состояния фильтра [г = 1 / х = 1,5, г = 2 / х = 2,00, г = 3 / х = 2,50, г = 4 / х = 3,00] и вероятности р <0,05) 5 и вручную проверять спектры MS для уверенной идентификации белка.
9. Представитель Результаты:
Мужские и женские нетренированного, мышиные скелетных мышц (бицепс плеча) был извлечен и разделяется на двумерной карте 5, первый уровень мышц сравнительный протеома (рис. 2). Как только визуализировать использованием высокого разрешения цифрового изображения; около 800 мест белка были обнаружены в каждом. Использование мужской протеома карту в качестве базового, ясно, что Есть много мест, которые изменяются в изобилии в женский протеома. Место интенсивности меры изменение белка количествах (рис. 3). Личности белковых пятен, которые изменяют более чем в два раза (вверх или вниз) и статистически значимы (р <0,05) с п = 5 мышей, определяются анализ последовательности аминокислот кислоты с использованием жидкостной хроматографии связью масс-спектрометрии. Эти результаты показывают, что женщины демонстрируют обилие снижение сахара ферментов энергетического обмена и фермента креатинкиназы (CK) изоформ, различные системы энергоснабжения в мышцах. Оба человека и животных дисплей выше мужской сывороточной КФК уровня в состоянии покоя и после тренировки 9,10, но сывороточной КФК уровни не обязательно коррелирует с количеством миофибриллярных нарушение 11,12. Этот гендерный диморфизм в сотовых обилие CK в мышиных мышц бицепса плеча роман finding5 и может ответить физиологически различные сыворотки CK уровнях.
Цифры:
g1.jpg "/>
Рисунок 1. Общая схема протокола для сравнительной протеомики. Протокола подразделяется на три группы: подготовка проб; анализ образцов, и, идентификации белков. Концы каждой из этих трех групп протоколов также разумной паузы местах, хотя наилучшие результаты получил, если общий протокол осуществляется без остановки.
Рисунок 2. Сравнение женщин мышиные белки бицепс плеча пятна относительно идентичных мест в мужской бицепс плеча (зеленые кружки о). Пятна, что рост больше или равно два раза у женщин обведены красным (о) и те, которые снизились меньше или равно два раза обведены синими (о).
Рисунок 3 Гель Пятно Интенсивность анализ:. Оси Х, женскийперед тренировкой (контроль, п = 5); Y-ось, женском одиночном бою 0 ч группу момент времени (п = 5). Линия регрессии: коэффициент корреляции = 0,919; наклон = 0,976; перехвата = -0,0293. Пятна выше красной линии и ниже синей линии изменяются более чем на + / - в два раза.
Discussion
LC / MS протеомики метод, представленный здесь, самый надежный и воспроизводимый протокол для экспресс-анализа первого уровня скелетных мышц протеома. Это позволяет разумно целесообразным сравнение гендерных специфику. Низкий белков обилие потребует фракционирования образцов мышц, чтобы удалить как многие из сократительных белков насколько это возможно, тем самым увеличивая низкие белков изобилии. Пошив протеома профиля может быть выполнена с различным рН IPG полосы и альтернативный гели градиент процент, если это необходимо. Более чувствительны флуоресцентные пятна существуют, но мы рекомендуем, чтобы каждая лаборатория определить линейность этих пятен в вашей системе. Для более тщательного анализа экспрессии белков системы ПГЛП (двумерный В-гель системы электрофореза, GE Healthcare Life Sciences) могут быть использованы, однако это действительно добавляет уровень сложности методологии. Кроме того, протокол описанное здесь может быть использован с большинством АниМал тканей, для которых генома была последовательной, а также заново последовательности белка из любого источника, до тех пор, как она может быть решена на двумерный гель, так как перекрытие ферментативной фрагменты могут быть созданы с помощью ферментов высокой чистоты в дополнение в трипсин. Образцы из других источников ткани может потребовать некоторых изменений в добыче методологии, особенно если ищете мембраны и гидрофобных белков, однако, у нас были хорошие результаты, используя этот протокол с сердечными, печени, почках и тканях мозга. Другие пост-трансляционной модификации могут быть обнаружены путем изменения массы критериям базы данных спектр поиска. В целом, мы представили достаточно подробную начальной протокол для протеома анализа профилирования.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Юйтянь Ган для использования на рисунке 3. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом 0420971; Smith College Блэйксли, Wilens и Холмс средств; и Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Consumable | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-89870 | |
| Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) | Consumable | Dionex | 162348 | |
| Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels | Consumable | Bio-Rad | 345-0106 | |
| Readystrip IPG strips | Consumable | Bio-Rad | Varying pH ranges | |
| Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
| Acetone | Reagent | Pharmco Products, Inc. | 329000 | |
| Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | Reagent | Bio-Rad | 163-2111 | Overlay solution |
| Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
| Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | Bio-Rad | Varying pH ranges |
|
| CHAPS | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 13361 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20278 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 15395 | |
| Formic acid | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28905 | |
| Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Glycine | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 16407 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
| Mineral oil | Reagent | Bio-Rad | 163-2129 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
| Tris[2-carb–xyethyl] phosphine | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 77720 | |
| Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 90055 | modified |
| Urea | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 75826 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365 | |
| Centrivap Concentrator | Tool | Labconco Corp. | ||
| Exquest spot cutter | Tool | Bio-Rad | ||
| LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
| Polypropylene stirring | Tool | Biospec Products | ||
| rods | ||||
| PROTEAN IEF cell | Tool | Bio-Rad | ||
| Sonicator | Tool | Branson | ||
| Surveyor Plus HPLC system | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| VersaDoc imaging system | Tool | Bio-Rad |
References
- Fehrenbach, E. Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).
- Mooren, F. C.
- Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans. Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).
- McHugh, M. P. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).
- Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome. Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).
- Lopez, J. L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis. J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).
- Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C.
- Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. Serum creatine kinase activity and body composition in males and females. Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).
- Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM. Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).
- Kendall, B., Eston, R. Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen. Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).
- Tiidus, P. M. Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair? Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).
