Ett experimentellt system för att studera Mechanotransduction i fetal lunga Celler
Summary
Mekaniska krafter spela en nyckelroll i lungutveckling och lungskada. Här beskriver vi en metod för att isolera gnagare fetal lunga typ II epitelceller och fibroblaster och att utsätta dem för mekanisk stimulering med användning av en<em> In vitro</em> System.
Abstract
Mekaniska krafter som genereras i livmodern genom återkommande andning-liknande rörelser och flytande buk är kritiska för normal lungutveckling. En viktig del av lungan utveckling är differentieringen av alveolära typ II epitelceller, den största källan till lungsurfaktant. Dessa celler deltar också i vätska homeostas i alveolära lumen, värd försvar och skada reparation. Dessutom kan distala lungparenkym cellerna direkt utsatt för överdriven stretch under mekanisk ventilation efter födseln. Men de exakta molekylära och cellulära mekanismer som lungceller känner av mekaniska stimuli för att påverka lung utvecklingen och främja lungskada inte helt klarlagd. Här ger vi en enkel och hög renhet metod för att isolera typ II-celler och fibroblaster från gnagare fetala lungor. Därefter, beskriver vi ett in vitro-system, i Flexcell Strain enheten, för att åstadkomma mekanisk stimulering till fosterceller, simulerande mekaniska krafter ifostrets lunga utveckling eller lungskada. Detta experimentella system tillhandahåller ett utmärkt verktyg för att undersöka molekylära och cellulära mekanismer i fetal lunga celler exponerade för att sträcka. Med detta tillvägagångssätt har vårt laboratorium identifierat flera receptorer och signalering proteiner som deltar i mechanotransduction i fetal lunga utveckling och lungskada.
Protocol
Discussion
I detta manuskript beskriver vi en metod för att isolera fetala typ II epitelceller och fibroblaster och att utsätta dem för mekanisk stimulering med stam Flexcell Apparatus. Vi har använt denna teknik för att bedöma differentiering av epitelceller 1,2 och för att studera receptor och signalvägar som aktiveras av sträckning 3-9. Dessutom kan denna metod även användas för att undersöka cellsvar som induceras av mekanisk skada 10,11. Förfarandet är baserat på nedbrytning av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av NIH bidrag HD052670.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5648 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | |
| Screen cups | Sigma | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, INC | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, INC | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma | V-0132 | |
| Elastin | Sigma | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R., Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. , 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
