Summary
De VisioTracker is een geautomatiseerd systeem voor de kwantitatieve analyse van de visuele prestaties van larvale en kleine volwassen vissen op basis van de registratie van oogbewegingen. Het beschikt over volledige controle over visuele stimulus eigenschappen en real-time analyse, waardoor high-throughput onderzoek op gebieden zoals visuele systeem ontwikkeling en functie, farmacologie, neurale circuit studies en sensomotorische integratie.
Abstract
Onderzoek naar het visuele systeem ontwikkeling en functie noodzakelijk kwantificeerbare gedragsmodellen van visuele prestaties die gemakkelijk te lokken, robuust en eenvoudig te manipuleren. Een geschikt model is gevonden in de optokinetische reactie (OKR) een reflexieve gedrag in alle vertebraten vanwege de hoge selectiewaarde. De OKR gaat langzaam stimulus-volgende bewegingen van de ogen afgewisseld met snelle reset saccades. De meting van dit gedrag wordt gemakkelijk uitgevoerd in zebravis larven, vanwege de snelle en stabiele onset (volle na 96 uur na bevruchting (HPF)), en profiteert van de grondige kennis zebravis genetica tientallen jaren een van de favoriete model organismen in dit gebied. Inmiddels is de analyse van soortgelijke mechanismen bij volwassen vis heeft aan belang gewonnen, met name voor farmacologische en toxicologische toepassingen.
Hier beschrijven we VisioTracker, een volledig geautomatiseerde, high-throughput systeem voor de kwantitatieve analyse van de visuele prestaties. Het systeem is gebaseerd op onderzoek dat is uitgevoerd in de groep van prof. Stephan Neuhauss en werd opnieuw ontworpen door TSE Systems. Het bestaat uit een immobiliseerinrichting voor kleine vissen bewaakt door een hoogwaardige videocamera met een hoge resolutie zoomlens. De vis houder wordt omgeven door een zeeftrommel, waarop computer gegenereerde stimulus patronen worden geprojecteerd. Oogbewegingen worden geregistreerd en geanalyseerd door automatisch de VisioTracker softwarepakket in real time.
Data-analyse maakt onmiddellijke erkenning van de parameters zoals langzame en snelle faseduur, bewegingscyclus frequentie, slow-fase winst, de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid.
Typische resultaten laten bijvoorbeeld de snelle identificatie van visuele systeem mutanten die geen duidelijke verandering in wild-type morfologie vertonen, of de beslissing van kwantitatieve effecten van farmacologische of toxische en mutageneagenten op visuele prestaties van het systeem.
Protocol
1. Fokken van vissen
Embryo's werden gehouden en opgevoed onder standaard condities (Brand 2002) en gefaseerde volgens de ontwikkeling in dagen na de bevruchting (DPF). Volwassenen en larven op 5 dpf werden gebruikt voor metingen.
2. Experimentele procedure
- Bereiding van instrument
Larven Vislarven werden ingebed in 3% voorverwarmde (28 ° C) methylcellulose bewegingen van het lichaam te voorkomen. De embryo's werden geplaatst dorsale zijde naar boven in de VisioTracker, tegenover de projectiescherm. Adult vis: vis waren kort verdoofd in 300 mg / l MS-222, gemonteerd in de immobiliseerinrichting en geplaatst in de VisioTracker. Voordat metingen werden gestart, werden ze overgelaten om te herstellen voor 1-2 minuten.
- Generatie van stimulus patronen
Stimulus patronen bestaande uit verticale zwart-wit sinus-golf roosters draaien rond de vis zijn gemaakthet gebruik van de eigen software pakket. Ze gemoduleerd kan worden door de software volgens golfvorm, contrast, intensiteit, hoeksnelheid en ruimtelijke frequentie. Patronen werden geprojecteerd op het scherm met behulp van een digitale projector licht dat zich binnen de VisioTracker. De afstand tussen de ogen van de vis en het scherm was 4,5 cm, en grootte van de projectie op het scherm was 360 graden horizontaal en 55 graden verticaal. Voor vislarven werd richting veranderd stimulatie met een frequentie van 0,33 Hz tot saccade te reduceren. Volwassen vissen werden uni-directioneel gestimuleerd en alleen het oog gestimuleerd in tijdelijke-to-neus richting werd beschouwd, omdat neus-aan-temporele oog snelheid in het algemeen beduidend lager en minder constant (zie Mueller en Neuhauss, 2010).
- Registratie van oogbewegingen
Een bright-field beeld van het hoofd van de vis werd toegevoerd aan een infrarood videocamera. Infrarood verlichting van vis heeft plaatsgevonden from hieronder. De camera opgenomen beelden met een snelheid van 5 frames / seconde (larven) of 12,5 frames / seconde (volwassenen), respectievelijk. Beelden worden automatisch verwerkt, gecorrigeerd en glad voor oogvorm. Eye oriëntatie ten opzichte van de horizontale as werd automatisch bepaald en oog snelheid werd berekend door de eigen software pakket. Kleine bewegingen van de vis automatisch gecorrigeerd door de software. Alle registratie en analyse werd bereikt in real time.
3. Post-experimentele gegevens verwerken
- Ruwe metingen van het oog snelheden werden gefilterd voor saccades om langzaam fasesnelheid halen.
- Saccade-gefilterde oog velocity curves werden afgevlakt door een lopend gemiddelde met een schuifraam van 7 frames.
- Eye snelheid was gemiddeld over frames met identieke stimulus voorwaarden.
- Voor vislarven, werd eye snelheid gemiddeld over beide ogen.
4. Representatieve resultaten:
Voor larvale zebravis, werd de bumper mutant gekozen. In deze mutant, lens epitheelcellen hyperproliferate, wat leidt tot verminderde lens grootte en ectopische locatie van de lens. Deze morfologische veranderingen worden gereflecteerd door een aanzienlijke vermindering van contrastgevoeligheid en gezichtsscherpte (Schonthaler et al.., 2010). Figuur 1 toont het verschil in contrast gevoeligheid van bumper mutanten versus wild-type siblings. Bumper mutanten steeds niet eye snelheid aanpassen als de stimulus contrast vermindert. Naar analogie wanneer de stimulus ruimtelijke frequentie verhoogd, dat wil zeggen de stimulus strookbreedte wordt verminderd, bumper mutanten ook demonstreren verminderde gezichtsscherpte (Fig. 2)
De afhankelijkheid van de volwassen zebravis Visual prestaties op omgevingsomstandigheden werd onderzocht door het onderwerpen van de vis verschillende concentraties alcohol in de tank water gedurende 30 minuten en vervolgens het meten van de response optokinetische onder wisselende omstandigheden stimulus. Volwassen zebravis tonen een duidelijke vermindering van contrastgevoeligheid als het wordt onderhouden in het verhogen van alcohol concentraties (afb. 3). Een soortgelijke dosisafhankelijke vermindering van de totale oog snelheid over een groot aantal ruimtelijke frequenties kan worden waargenomen wanneer de vis werden behandeld met oplopende concentraties alcohol (Fig. 4). Alcoholbehandeling verder dosisafhankelijke daling oculomotor prestaties bij veeleisende taken zoals bijvoorbeeld verhoogde snelheid stimulus (Fig. 5).
Figuur 1. Zebravis larvale oog snelheid is afhankelijk van stimulus contrast. 10 bumper mutanten en 10 wild-type broers en zussen werden geanalyseerd bij 5 dpf onder wisselende s timulus streep contrast. Grafiek toont de gemiddelde snelheid eye ± 1 SEM.
Figuur 2. Zebravis larvale oog snelheid is afhankelijk van ruimtelijke frequentie. 10 bumper mutanten en 10 wild-type broers werden onderworpen aan verschillende breedtes stimulus streep op 5 dpf en geanalyseerd zoals beschreven. Grafiek toont de gemiddelde snelheid eye ± 1 SEM.
Figuur 3. Volwassen zebravissen tonen alcohol concentratie-afhankelijke vermindering van contrastgevoeligheid. Volwassen zebravissen werden in verschillende concentraties alcohol zoals aangegeven gedurende 30 minuten en geanalyseerd onder verschillende stimulus streep contrast. Grafiek toont de gemiddelde tijd naar nasale eye snelheid ± 1 SEM van 9 vis per groep (met uitzondering controlegroep: n = 11).
e 4 "src =" / files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg "/>
Figuur 4. Volwassen zebravissen tonen alcohol concentratie afhankelijke vermindering van de totale oogbeweging over een breed bereik van stimulus strookbreedte. Volwassen zebravissen werden in verschillende concentraties alcohol zoals aangegeven gedurende 30 minuten en geanalyseerd onder verschillende stimulus strookbreedte voorwaarden. Grafiek toont de gemiddelde tijd naar nasale eye snelheid ± 1 SEM van 9 vis per groep (met uitzondering controlegroep: n = 11).
Figuur 5. Volwassen zebravissen tonen alcohol concentratie afhankelijke vermindering van de totale oogbeweging op diverse snelheden stimulus. Volwassen zebravissen werden in verschillende concentraties alcohol zoals aangegeven gedurende 30 minuten en geanalyseerd onder verschillende stimulus snelheid. Grafiek toont de gemiddelde tijd naar nasale eye snelheid ± 1 SEM van 9 vis per groep (met uitzondering controlegroep:n = 11).
Discussion
Het belang van de OKR voor de studie van de visuele functie is erkend in de wetenschappelijke gemeenschap voor een lange tijd (Pasen & Nicola 1996, 1997), en pogingen om echt te kwantificeren het paradigma hebben ruim tien jaar geleden begonnen. Pasen en Nicola (1996) ontwikkelde een systeem met gemotoriseerde roterende gestreepte drums, waar de video-opname van oogbewegingen handmatig werd geanalyseerd. Dit systeem leed aan een gebrek aan immobilisatie van de vis embryo, dat veelvuldig handmatig herpositionering nodig, en kon de tracking bewegingen van de ogen te detecteren slechts met grote moeite. Een stap vooruit was het gebruik van een video-geprojecteerde gestreepte trommel mogelijk te maken meer variabele computer gegenereerde stimulus (Roeser & Baier, 2003;. Rinner et al., 2005a).
De veelal handmatig, frame-voor-frame analyse van video opgenomen opnamen heeft bewezen zeer bewerkelijk en in zekere mate belemmerd door waarnemer bias (Beck et al..,2004). Geautomatiseerde analyse in real-time werd voorgesteld om het gebruik van gedrags feedback leermechanismen (Major et al., 2004). Mogelijk. Het gebruik van infrarood verlichting en frequentie gestuurde roterende stimuli is ontwikkeld door Beck et al.. (2004). Echter, het systeem daar beschreven is alleen gebruikt voor larven, en de analyse werd uitgevoerd off-line. Bovendien kan de VisioTracker volledige controle over stimuli, bijvoorbeeld de verandering stimulus tijdens het experiment, waardoor een grotere flexibiliteit en spontane invloed op het verloop van het experiment. Ook de creatie digitale stimulus die de problemen overwonnen VisioTracker met eerder genoemde versnelling van de massa van een inert gestreepte stimulus drum (Beck et al., 2004)..
Larven terughoudendheid van methylcellulose niet significant interfereert met oogbeweging en heeft geen lange-termijn effecten op de zebravis welzijn. Vislarven zijn met succesonderhouden ingebed in methylcellulose voor meerdere dagen, totdat de zuurstoftoevoer via de huid wordt onvoldoende zijn voor de vraag met toenemende leeftijd (Qian et al.., 2005).
De volwassen vissen straatverbod methode is net zo gemakkelijk op het dier. De korte duur van het experiment, in combinatie met de mogelijkheid snel wisselen het proefdier voor een ander, drijft de positieve dierenwelzijnsaspecten van het systeem. Aangezien de kieuwen continu gespoeld met water, is het handig om de spike water met een chemisch keuze om het effect te bestuderen op oogbewegingen en visuele prestaties. Ook een wash-out experiment worden toegevoegd zonder dat het dier tussen de experimenten behandelen.
Pixelruis in het videobeeld werd geminimaliseerd door het gladstrijken algoritmen van de specialiteit VisioTracker software, waardoor zeer precieze metingen van ooghoogte en hoeksnelheid. Bovendien vergemakkelijken statistischeanalyse de software uitgefilterd saccade bewegingen die optreden op vaste snelheid en dragen niet bij aan de experimentele statement. Een middeling van velocity curves meer dan 7 videoframes vergemakkelijkt latere analyse.
De VisioTracker opent een nieuwe dimensie voor vele gevarieerde onderzoeksgebieden. Het systeem en zijn voorgangers hebben al met succes zijn gebruikt om visuele prestaties in de zebravis larven kwantificeren, met behulp van parameters zoals gezichtsscherpte, contrastgevoeligheid en licht aanpassing (Rinner et al.., 2005a, Schonthaler et al.., 2010), voor functionele analyse van kegel fotoreceptoren na manipulatie van de leden van de visuele transductie cascade (bijv. Rinner et al., 2005b, Renninger et al., 2011.)., of de analyse van visuele gebreken in mutant zebravis larven (bijv. Schonthaler et al., 2005, 2008;. Bahadori et al.., 2006). De onderlinge afhankelijkheid van morfologische en functionele rijping van het visuele systeemis bestudeerd door OKR metingen blijkt dat gezichtsscherpte voornamelijk maar niet volledig beperkt fotoreceptor ruimte aan larvale stadia (Haug et al.., 2010).
De VisioTracker is even geschikt als visuele functie te analyseren bij volwassen zebravissen en andere vergelijkbare grootte vissoorten (Mueller en Neuhauss (2010), dit rapport).
Het is ook denkbaar om het systeem te gebruiken in onderzoeksgebieden zoals toxicologie of farmacologische waarbij stoffen worden onderzocht kunnen worden toegevoegd aan het water rond de volwassen vissen kieuwen. Bovendien is de veelzijdigheid van VisioTracker maakt grondiger analyses van bijvoorbeeld ontogenetics van de visuele functie, neurale circuit functie en ontwikkeling, of sensorimotorische controle (zie review in Huang & Neuhauss, 2008).
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach en Holger D. Russig zijn medewerkers van TSE-Systems GmbH dat de visuele prestatie volgsysteem gebruikt in dit artikel oplevert. De productie van dit artikel werd gesponsord door TSE-Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass is een medewerker van de Universiteit van Zürich, die vergoeding ontvangt door TSE Systems per verkochte systeem.
Acknowledgments
KPM werd ondersteund door de EU KP7 (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
- Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome. Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).
- Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms. Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).
- Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C. Keeping and raising Zebrafish. Zebrafish, Practical Approach Series. Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Visual acuity in zebrafish: behavior and histology. Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).
- Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).
- Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).
- Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish. Zebrafish. 2, 189-196 (2005).
- Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae. Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).
- Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).
- Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 Forthcoming.
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum. J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).
- Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles. Development. 135, 387-399 (2008).
- Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness. Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).
- Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. von, Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision. Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).
