يوصف نظام 3D من غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في مستويات عالية من السائل الزليلي. السائل الزليلي يعكس المكروية الطبيعية لمعظم الغضروف المفصلي ، ويمكن الحصول عليها بسهولة وتخزينها. هذا النظام بالتالي يمكن استخدامها لدراسة تجديد الغضاريف والتداوي الفرز لعلاج التهاب المفاصل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ونظام 3D لغضروفية التثقيف مفصلي الإنسان في السائل الزليلي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الغضروف التدمير هو سمة مركزية المرضية لالتهاب المفاصل ، وهو السبب الرئيسي للعجز في الولايات المتحدة. الغضروف في البالغين لا تتجدد بشكل فعال جدا في الجسم الحي ، ونتيجة لذلك ، يؤدي الى هشاشة العظام لا رجعة فيه فقدان الغضروف ويترافق الألم المزمن و1،2 الجمود. الغضروف هندسة الأنسجة إمكانات واعدة لتجديد واستعادة وظيفة الأنسجة. هذه التكنولوجيا عادة ما ينطوي على غضروفية البذر في السقالات الطبيعية أو الاصطناعية واستزراع 3D الناتجة بناء في وسط متوازن على مدى فترة من الزمن بهدف للهندسة الأنسجة كيميائيا وناضجة biomechanically التي يمكن زرعها في موقع الخلل في الجسم الحي 3-6 . تحقيق شرط الأمثل للنمو خلية غضروفية وترسب مصفوفة أمر ضروري لنجاح هندسة الأنسجة الغضروف.
في الغضروف الأصلي مشتركة ، تجويف في القطب الشماليواستحم سطح جزيئية من العظام في السائل الزليلي. هذا السائل اللزج واضحة وتوفر المواد المغذية إلى الغضروف المفصلي لاوعائي ويحتوي على عوامل النمو ، والسيتوكينات والأنزيمات التي تعتبر مهمة لعملية الأيض 7،8 خلية غضروفية. علاوة على ذلك ، السائل الزليلي يسهل حركة منخفضة الاحتكاك بين الأسطح الغضروفية أساسا من خلال إفراز عنصرين رئيسيين ، وhyaluronan lubricin 9 10. في المقابل ، غالبا ما يتم تربيتها الغضروف الأنسجة المهندسة في وسائل اصطناعية. في حين أن وسائل الإعلام هذه على الأرجح قادرة على توفير ظروف أكثر تحديدا لدراسة الأيض خلية غضروفية ، السائل الزليلي أدق تعكس البيئة الطبيعية التي تتواجد فيها غضروفية مفصلي
في الواقع ، السائل الزليلي لديها ميزة كونها سهلة للحصول على وتخزينها ، وكثيرا ما يمكن تجديدها بشكل منتظم من قبل الجسم. وقد استكملت عدة مجموعات في مستنبت مع السائل الزليلي في نمو الإنسان ، والأرانب والأبقار والكلاب جhondrocytes ، ولكنها تستخدم في الغالب سوى مستويات منخفضة من السائل الزليلي (أقل من 20 ٪) 11-25. في حين تم تربيتها الدجاج والخيول والإنسان غضروفية في المتوسط مع ارتفاع نسبة السائل الزليلي ، وكانت هذه النظم ثقافة ثنائية الأبعاد 26-28. هنا نقدم أسلوبنا في غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في نظام 3D مع نسبة عالية من السائل الزليلي (تصل إلى 100 ٪) خلال فترة 21 يوما. في القيام بذلك ، تغلبنا على عقبة رئيسية قدمها اللزوجة العالية من السائل الزليلي. هذا النظام يتيح إمكانية دراسة غضروفية الإنسان في السائل الزليلي في وضع 3D ، والتي يمكن دمجها مع عوامل أخرى الهامتين الأخرى (توتر الأوكسجين والتحميل الميكانيكية) 29،30 التي تشكل البيئة الطبيعية لغضروف لمحاكاة الوسط الطبيعي غضروف النمو. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن يستخدم هذا النظام لمعايرة السوائل على النشاط الزلالي غضروفية وتوفير منبر للتطويرالغضروف تجديد التقنيات والخيارات العلاجية لالتهاب المفاصل.
البروتوكول
نظام 3D لغضروفية زراعة مفصلي الإنسان في السائل الزليلي
في هذا العمل ، ونحن مغلفة غضروفية مفصلي الإنسان في الخرز باستخدام الجينات المعدلة صناعة التغليف ، واقترح البروتوكول (Lonza ، و 31). تستخدم هذه التركيبات 3D ، وقد وضعنا نظاما لزراعة الخلايا في مستنبت تحتوي على نسب مختلفة من السائل الزليلي الإنسان وقيم وثوابت هذه 3D للتعبير الجين الغضروف.
1. إعداد غضروفية مفصلي الإنسان (HAC) لتغليف (3D) ثلاثية الأبعاد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير ، طورنا أسلوب الذي يسمح لثقافة غضروفية مفصلي الإنسان في بيئة 3D في المتوسط يحتوي على تركيزات عالية من السائل الزليلي الإنسان. السائل الزليلي هو واحد من العناصر الرئيسية التي تشكل البيئة الطبيعية في تجويف مشتركة ، حيث يقيم غضروفية مفصلي. ومع ذلك ، فقد كان لزوجة السائل الزليلي تحديا رئيسيا للزراعة على المدى الطويل ثلاثية الأبعاد من غضروفية. للتغلب على التحدي المتمثل في الحفاظ على توزيع المواد الغذائية حتى في بناء التجميع في بيئة لزجة ومنع 3D ، وضعنا تحت الغضروف يبني.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
نود أن نشكر روبن ناي (المركز الطبي لجامعة تافتس) ، ودانا اوشيمورا تومويا كيرنز (جامعة تافتس) لتقديم المساعدة في تخزين السائل الزليلي والطرد المركزي. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1R01AR059106 - 01A1) لLZ
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
جدول محدد الكواشف والمعدات :
| اسم الكاشف | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
|---|---|---|---|
| ألجينات (حمض الألجنيك ملح الصوديوم) | سيغما | A2158 - 250G | حل تخزين 2.4 ٪ عند 40 درجة مئوية |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات ، محبب | JT بيكر | A19339 | |
| وسائل الإعلام مكون للغضروف النمو | Lonza | CC - 3156 (قاعدة وسائل الإعلام) | |
| CC - 4409 (تكملة) | |||
| وسائل الإعلام التمايز مكون للغضروف | Lonza | CC - 3226 (قاعدة وسائل الإعلام) | |
| CC - 4408 (تكملة) | |||
| غضروفية مفصلي الإنسان | Lonza | CC - 2550 | |
| دابي (4 '،6 - Diamidino - 2 - phenylindole هيدروكلوريد) | سيغما الدريخ | D9542 | |
| RNeasy مجموعة صغيرة (لاستخراج الحمض النووي الريبي) | Qiagen | 74104 | |
| PCR الكواشف : SYBR الخضراء | كمات | 95053-500 | |
| محقنة 12 مل | تايكو - كيندال Monoject | 512852 | |
| 22 Gague إبرة تحت الجلد | تايكو - كندالL - Monoject | 8881 | |
| مجهر | اوليمبوس | IX71 | |
| منصة الروك | Thermoscientific thermolyne | فاري مزيج | |
| تسلسل الاشعال | |||
| الكولاجين الداخليين إلى الأمام | 5' - TTC ATC CCC CCA TCT كاك AGT - 3 ' | ||
| الكولاجين الداخليين والخلف | 5' - CCTCTGCCTTGACCCGAA - 3 ' | ||
| MMP13 إلى الأمام | 5' - TGT دول مجلس التعاون الخليجي CTT CTT كاك ACA GAC ACT - 3 ' | ||
| MMP13 والخلف | 5' - AGC GAG TGA AGA CTT GTC ATT دول مجلس التعاون الخليجي 3 ' | ||
| Caspase 3 إلى الأمام | 5' - TCA TTA TTC AGG CCT دول مجلس التعاون الخليجي GTG GTA - 3 ' | ||
| Caspase 3 العكسي | 5' - TGG ATG شكيمة CAG AAC CCA TCC TTT -3 " |
المراجع
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
