Summary
זבוב הפירות,
Abstract
כדי לחקור רשתות נוירונים מבחינת תפקידם בהתנהגות, עלינו לנתח כיצד נוירונים פועלים כאשר כל דפוס התנהגות נוצרת. לפיכך, הקלטות בו זמנית של הפעילות העצבית התנהגות חיוניים, כדי לקשר בין פעילות המוח להתנהגות. עבור ניתוחים התנהגות כאלה, זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאפשרת לנו לשלב אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון GCaMP 1, כדי לפקח על הפעילות העצבית, ולהשתמש מניפולציות גנטיות מתוחכמות עבור טכניקות optogenetic או thermogenetic באופן ספציפי הפעל זיהו נוירונים 2-5. השימוש בטכניקה thermogenetic הוביל אותנו למצוא נוירונים קריטיים עבור התנהגות האכלה (המבול et al., תחת גרסה). כחלק העיקרי של התנהגות האכילה, בוגר תסיסנית מרחיב חוטם שלה להזנת 6 (בתגובה חוטם הארכה; PER), מגיב לגירוי מתוק מתאי החישה על חוטם שלה או טרסי. שיתוףmbining פרוטוקול PER 7 עם טכניקה סידן באמצעות הדמיה 8 GCaMP3.0 1, 9, הקמתי מערכת ניסיונית, שבה אנו יכולים לעקוב אחר פעילות של נוירונים במרכז האכלה - גנגליון suboesophageal (SOG), בו זמנית עם תצפית התנהגותית של חוטם את. אני עיצבו מנגנון ("המוח פליי חיים הדמיה שלב Electrophysiology": "זבובים") כדי להתאים למבוגרים תסיסנית, המאפשר חוטם שלה כדי לנוע בחופשיות תוך המוח שלה חשוף אמבטיה עבור Ca 2 + הדמיה דרך העדשה טבילה במים . הזבובים מתאים גם סוגים רבים של ניסויים חיים על המוח לעוף כמו הקלטה אלקטרו או זמן לשגות הדמיה של מורפולוגיה הסינפטי. כי את התוצאות של הדמיה חיה יכול להיות מתואמים ישירות עם התנהגות PER בו זמנית, מתודולוגיה זו יכולה לספק מערכת ניסיונית מצוינת ללמוד עיבוד מידע של רשתות נוירונים, ואיך זה גפעילות ellular מצמידים לתהליכים פלסטיק זיכרון.
Protocol
1. לבנות את הזבובים
- לעצב את הפלטפורמה ממכסה של צלחת 35 מ"מ פלקון ידי המסת דפנות וגילוף זה כדי ליצור זווית בעובי המתאים (איור 1 א ', איור 2). לקדוח חור במצע לקבל את ראש זבוב (איור 1 א, ב), כך את איברי הפה חשופים באופן חופשי לחלק החיצוני של חדר (איור 1 א). חותכים את הקצה של קצה Pipetman, עם גודל התאמת זבוב כדי לצפות. הדבק קצה לפלטפורמה כפי שמוצג באיור 1 א כדי להשלים את הזבובים (איור 2).
2. הכנת טוס לצורך השגחה
- להרעיב את הזבוב הבוגר במשך 24 שעות במהירות של 25 ° C לפני הניסוי, על ידי הצבתו בתוך בקבוקון עם מגבת נייר רטוב בלבד, אם רעב הוא הכרחי.
- להרדים את הזבוב ידי הצבתו בתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל עומד על קרח.
- באמצעות מלקחיים, הכנס זבוב לתוך תא שלזבובים, בעדינות זבוב עד שהוא לא מסוגל לזוז. לאחר מכן, להוסיף תוסף כדי לשמור על זבוב. (איור 1 א, ב).
- לאטום את החלקים שמסביב של חוטם הפרוקסימלית (הבמה) עד לקצה הפנימי של החור, למרוח כמות קטנה של דבק אור ריפוי (Tetric EvoFlow) לצדדים ומעל דוכן מבחוץ (חצים באיור 3). כמו כן, החל את הדבק מבפנים הזבובים לחלל בין החלק הגבי של הראש לקצה הפנימי של החור (1B איור). כדי לאפשר במה לנוע בחופשיות, יש להיזהר כדי למנוע כל דבק מגע הבמה באמצעות עפעף (או משהו דומה) כדי להפיץ את הדבק. לבסוף, לרפא את הדבק עם התאורה החלשה של אור כחול מספיק לרפא כדי למנוע נזק זבוב מחום יתר. הסר את תקע.
- חוט כדי להחזיק את הבמה מבוטלת חלקית (חץ איור 3) עשוי להיות מועסק על מנת לייצב את זבוב "של ראש על ידי הימנעות בליטה של חלק בלוע כדי SOG ולחשוף את החלק הגחוני של SOG, במיוחד עבור מסופי הדמיה presynaptic של נוירונים Gr5a 8, אשר מכוסים על ידי חלק של הלוע, כאשר חוטם הוא חזר בו באופן מלא.
- מלא את פני השטח של פלטפורמה עם המכילים סוכר ללא מלח (מ"מ): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4.5, CaCl 2, 1.5, ו-HEPES NaOH, 5 עם pH של 7.1 10. זה מלוחים סוכרוז ללא יש tonicity דומים לאלה של נפוץ בשימוש סוכרוז המכיל salines כגון HL3.1 11.
- לפתוח את הראש הקפסולה באמצעות סכין טונגסטן מלקחיים עם עצות כמו מספריים מחודדים, שהוא מכשיר מחוייט ועוצב במקור על ידי ד"ר Kageyuki Yamaoka, יפן, אל הסרטון לציפורן ואת קנה הנשימה לחשוף SOG (איור 4). קצה הגחון של לציפורן הראש נחתך כמו הגחון ככל האפשר ואילו חתך בקצה הגב לא היה קריטי. ראשית, חתך דרךבקצה האחורי באמצעות סכין טונגסטן. לאחר מכן, לחתוך בצד את הקצוות הקדמי באמצעות מלקחיים מחודדים. פיסת העור המת חתך יש הרים עם מלקחיים את הסיר. העצבים אנטנות מחושים יש לגזור על ידי מלקחיים מחודדים.
- כדי למנוע חפצים התנועה במהלך ההקלטות, המוח חייב להיות מיוצב באמצעות הסרת חלקים מסוימים של זבוב. ראשית, להסיר באופן סלקטיבי שקי אוויר בין SOG ו לציפורן. חותכים את הוושט בסוף לכיוון הלוע ובסוף נכנס SOG להסיר את הקשר בין הלוע ואת המוח. אחר כך שולף שריר 16 12, ולבסוף, לנתק את כל קנה הנשימה חיבור המוח לציפורן.
- קבענו הזבובים שלנו על הבמה של מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision ב PerkinElmer) (איור 5). טבילה במים העדשה, למשל 40X/0.8 NA, היה שקוע לאמבטיה (איור 6
3. Ca 2 + הדמיה של המוח
- Ca 2 + הדמיה באמצעות GCaMP3.0 1, 9 בוצעה באמצעות שיטת שהוקמה על ידי מרלה et al. 8 (איור 6). באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal (Improvision), לקחת חלק אופטי יחיד 4Hz עם זמן חשיפה של 122ms באמצעות 491nm לייזר עירור, תוך התמקדות על האזור של עניין (גוף התא של הנוירון המוטורי, או interneuron או מסופי presynaptic של עצב סנסורי התעורר אצלם) עם תוכנת מהירות, ver. 4.3 (Improvision).
4. מגרה את חוטם
- Aspirate 100mm סוכרוז בתמיסה מימית לתוך מחט המזרק עם פתיל קטן (היא עשויה מנייר washi יפנית, ראו טבלה של חומרים כימיים מסוימים) בולט מקצה (איור 7).
- לפרוק טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז על הפתיל, אם כן, לשאוב אותו, מיד beforדואר יישום הפתיל נייר ספוג washi אל קצה חוטם את. הפתיל נייר washi צריך להיות מיושם רק לרגע, כדי למנוע שובע (איור 8). מעקב אחר תגובת הרחבה חוטם (PER) התנהגות באמצעות מצלמת CCD מחובר מיקרוסקופ לנתיחה (איור 5) בו זמנית עם Ca 2 + הדמיה. נתונים יש להביא בתוך שעה לאחר תחילת לנתיחה, כי התגובה PER לא נשמר יותר משעה בתנאים אלה.
5. נציג תוצאות
הנוירונים המוטוריים של מד הזווית הבמה, זוג השרירים העיקריים האחראים על הרמת דוכן להארכת חוטם, דווחו להראות התגובות לגירויים חזקים מתוקים 13. איור 9 מראה של CA 2 + אותות דרך GCaMP3.0 1, 9 לידי ביטוי גל 4 הנהג, E49 13, מגוף התא של הנוירון המוטורי. כפי שניתן לראות בסרטון, robuרחוב PER נצפתה בתיאום עם עלייה Ca 2 + האות.
באיור 1. סכמטי של המוח פליי חיים הדמיה Electrophysiology שלב (זבובים). , הזבובים בנוי כך הזווית של הקיר מאפשר ראש זבוב לצאת ישר. שלושה קטעים של חוטם זבובים הם בצבעים, במה הוא מגנטה. זבוב מוכנס לתוך החדר עם מלקחיים, וחתיכת לחתוך מסוף עצה Pipetman הוא פקוק לתוך האחורי של החדר כדי לחסום את זבוב לברוח. ב 'חור משועמם כדי להתאים את ראשו של זבוב. הפערים שנותרו סגורים עם דבק אור ריפוי כמצוין כדי להבטיח שאין נזילות. אחרי דבק ריפא, עצה Pipetman כמו תקע מוסר. מלח הוא שפך לתוך את הזבובים האלה כי פני השטח של המוח מכוסה לחלוטין. יש להבטיח כי אין דליפה מלוחיםלאינג אל הקצה הקדמי של הראש זבוב. אזור מוצל מוקף בקו מקווקו בלוח ב 'מראה את החלק שיש גזור החוצה.
איור 2. תצלום של הזבובים. הקיר בצורת חצי סהר של דבק (מאקדח דבק) נעשה כדי לשלוט על זרימת תמיסת מלח במהלך זלוף, וכדי להפחית את כמות מלוחים בשימוש.
איור 3. תצוגה חזיתית של זבוב רכוב הזבובים. תמונה זו מראה כיצד זבוב מוגדר הזבובים, ואיך דבק אור ריפוי מוחל סביב ראשו של זבוב (חיצים) כדי ליצור חותם מלוחים הוכחה. אם כל ההדלפות מלוחים ועד החדק של זבוב, אז הניסוי ייכשל. חוט (ראשי חץ) קשור בשלב זה לקיים את חוטם במצב, כך שזה לא retrac לחלוטין טד. אחרת זה היה לחסום את החלק הגחוני יותר SOG ולגרום חפצים ותנועה.
באיור 4. העליונה לאור את הזבובים זבוב גזור. תמונה זו מראה SOG חשיפה של הסרת העור המת הבאה לטוס. הוושט, שריר 16 ו tracheae מחובר למוח, כמו גם נבחרות אוויר שקי גם הוסר כדי למנוע מהם להפריע את המוח, מה שעלול להוביל את החפצים אותות סידן.
איור 5. מכשיר ניטור. מנגנון זה מורכב מ מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision), וצד רכוב Nikon SMZ800 מיקרוסקופ. התקנה זו מאפשרת הדמיה חי של פעילות המוח במהלך PER התנהגות.
6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
איור 6. תמונות להצגה הצדדית של הזבובים. שכבה דקה של תמיסת מלח דחוקה בין עדשת מים לטבילה 40X ו זבוב.
איור 7. סכמטי להכנת פתיל נייר washi. יפני דקיק-washi הנייר הוא קלף יפני מסורתי שהוא דק מאוד חלקה (Haibara, יפן). הוא גם חזק מאוד והוא יכול לשמור על כמות גדולה של נוזלים. נייר washi יש לחתוך טרפז עם ממדים ספציפיים מאוד, 0.3 מ"מ ו 0.7 מ"מ רוחב, ו - 4-5 מ"מ באורך (א). זה טרפז מוכנס לתוך קצה מחט המזרק G 23 מהצד 0.7 מ"מ ניתן התייצב דרך הכניסה של סיכה חרק, אשר כפופות לצורה-V (ב). ג, נייר הופך washi החשיפה הבאה שקוףלנוזל, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור ניסוי זה.
איור 8. גירוי של חוטם על לזבובים בעלי הפתיל-washi. הפתיל נייר washi בקצה של מחט המזרק מוחל לרגע באמצעות מניפולטור ג'ויסטיק ביד אחת. המחט מחוברת דרך צינור גמיש כדי ההזרקה מניפולציות עם זאת, עבור aspirating ופריקה פתרון סוכרוז.
איור 9. נציג תוצאות. ולדירה, התנהגות רשמה באמצעות מצלמת CCD מותקנת סטראו. צפיות הקדמי של זבוב מורעבת עם כ חוטם ארוך (חיצים) לפני גירוי, על גירוי, ואחרי גירוי עם הפתיל המכילה 100 סוכרוז mM מימית פתרון (ראש חץ). תאורה נעשה על ידי לייזר 491 ננומטר שימושעבור GCaMP פלואורסצנטי. ב, סוכרוז הנגרמת GCaMP 3.0 תגובה הנוירון המוטורי של מד הזווית של שריר דוכן במצב הרעבה. הפאנל העליון, לפני גירוי, הפאנל התחתון, מיד לאחר הגירוי. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. ג, כימות בתגובה סוכרוז הנגרמת 3.0 GCaMP. הנוירון המוטורי מגיב לגירוי סוכרוז על ידי גידול חד של הקרינה ואחריו שלב החזרת מספר שניות עד לקו הבסיס.
Discussion
הזבובים מאפשר הקלטה בו זמנית של Ca 2 + האותות והתנהגות למשק. גם עם המוח נחשף להתנהגות מלוחים PER רגיל נצפתה. באמצעות פתיל יפני דקיק-washi במקום הפתיל Kimwipe שימוש method7 נימי המקורי מאפשר התנהגות PER לשחזור מאוד יציבה מונעת את הצורך להיות מיומנים בקבלת ובחירת הפתיל Kimwipe טוב. העצות הניסוי האמור לעיל אפשר לנו בהצלחה למנוע הפרות סדר על ידי תנועה של חוטם, שמוביל הקלטה יציבה מאוד של Ca 2 + אותות עם רעש נמוך. מדי פעם, הסרת הרקמה לא היה די כדי לחשוף תאים או לדכא את התנועה כראוי, מה שמוביל לתוצאות עניים. עם זאת, ברגע שהיינו מיומן, יותר מ 80% של ההכנות הניב תוצאות טובות. מתודולוגיה זו היא לא רק Ca 2 + הדמיה, אבל יכול גם להיות מותאם הדמיה כל חי תוך שמירה על PER התנהגות. לדוגמה, אנו יכולים לגשת לכל תא באמצעותהשימוש אלקטרודות ישירות להקליט פעילות. בשילוב עם מיקרוסקופ שני הפוטונים עירור, אנו מסוגלים לבצע זמן לשגות הדמיה של מבנה סינפטי, מה שיכול להיות קשור לשינויים התנהגותיים. לכן, שיטה זו של הדמיה מוחית עם תצפית התנהגותית היא לא רק ערך לנתיחה פונקציונלי של הרשת העצבית, אך יכול לשמש ככלי רב עוצמה, כדי לקשר בין 14 הפלסטיות הסינפטית את המנגנונים מאחורי הזיכרון.
Acknowledgments
אני מודה ל ווטנבה, M Gorczyca וחברים אחרים במעבדה Yoshihara להערות שימושיים דיונים. אני מודה סקוט ק 'ול' Looger למניות זבובים, S Yokoyama להפגין ניסויים, Shinya Iguchi לעזרה טכנית, נובוקו Yoshihara על מידע מהותי. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי מענקי בריאות הנפש MH85958, וקרן Worcester ל שלי
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
