Summary
Bananfluen,
Abstract
At studere neuronale netværk i forhold til deres funktion i adfærd, må vi analysere, hvordan neuroner fungerer, når hver adfærdsmønster er genereret. Således samtidige optagelser af neuronal aktivitet og adfærd er afgørende for at korrelere hjernens aktivitet til adfærd. For sådanne adfærdsmæssige analyser giver frugtflue, Drosophila melanogaster, os at inkorporere genetisk indkodede calcium indikatorer såsom GCaMP 1 til overvågning af neuronal aktivitet, og at anvende avancerede genetiske manipulationer for optogenetic eller thermogenetic teknikker til specifikt at aktivere identificeret neuroner 2-5. Anvendelse af en thermogenetic teknik har ført os til at finde kritiske neuroner til fodring adfærd (Flood et al., Er under revision). Som en væsentlig del af spiseadfærd, strækker sig en Drosophila voksen dens snabel til fodring 6 (snabel forlængelse respons, PER), svarer til en sød stimulus fra sanseceller på dens snabel eller tarsi. Combining protokollen for PER 7 med en calcium imaging teknik, 8 ved hjælp GCaMP3.0 1, 9, har jeg oprettet et eksperimentelt system, hvor vi kan overvåge aktiviteten af neuroner i fodringen centrum - suboesophageal ganglion (SOG), samtidig med adfærdsmæssige observation De proboscis. Jeg har udviklet et apparat ("Fly hjerne aktuel Imaging og Elektrofysiologi Stage": "flyver") til at rumme en Drosophila voksen, så dets proboscis frit bevæge sig, mens dens hjerne udsættes badet for Ca2 +-billeddannelse gennem en nedsænkning i vand linse . Fluerne er også velegnet til mange typer af levende eksperimenter på Fly hjerner som elektrofysiologiske optagelse eller tidsforskydningen billeder af synaptisk morfologi. Idet resultaterne fra levende billeddannelse kan korreleres direkte med den samtidige PER adfærd, kan denne metode giver et fremragende eksperimentelle system til at undersøge information behandling af neurale netværk, og hvor det Cellular aktivitet er koblet til plast processer og hukommelse.
Protocol
1. Konstruktion af de FLUER
- Forme en platform fra låget 35 mm Falcon skål ved smeltning sidevæggen og udskæring det at danne en passende vinkel, og tykkelsen (figur 1a, fig 2). Bore et hul i platformen til at acceptere fluen hovedet (figur 1a, b), således at munddelene frit eksponeret på ydersiden af kammeret (figur 1a). Skære enden af en Pipetman spids, med størrelsen matchende fluen skal overholdes. Lim spidsen til platformen, som vist i figur 1a til at fuldføre de fluer (figur 2).
2. Klargøring af Fly til observation
- Sulte en voksen flue i 24 timer ved 25 ° C forud for eksperimentet ved at placere den i et hætteglas med kun en våd papirhåndklæde, hvis sult er nødvendig.
- Bedøve fly ved at anbringe den i en 15 ml plastrør stående på is.
- Med pincet, en flue indsættes i kammeret iFLUER, og skub forsigtigt fluen ind, indtil det er ude af stand til at bevæge sig. Derefter sætter et stik at bevare fluen. (Figur 1a, b).
- Forsegle de omgivende dele af den proximale proboscis (pandetornen) til den indvendige kant af hullet, anvende en lille mængde af lys-hærdende lim (Tetric EvoFlow) til siderne og over pandetornen udefra (pile i figur 3). Også anvende lim fra indersiden af fluerne til rummet mellem den dorsale del af hovedet og den indvendige kant af hullet (figur 1b). For at give talerstolen til at bevæge sig frit, bør der udvises forsigtighed for at undgå lim rører talerstolen ved hjælp af en øjenvippe (eller noget lignende) for at sprede limen. Endelig hærde limen med den svageste belysning af blåt lys nok til at kurere for at undgå at beskadige fly fra overdreven varme. Tag stikket.
- En tråd til at holde talerstolen delvis løftet (pil i figur 3) kan anvendes til at stabilisere i fartenhoved ved at undgå bule på pharynxregionens del SOG og at eksponere den ventrale del af SOG, især for billeddannelse præsynaptiske terminaler Gr5a neuroner 8, som er dækket af en del af svælget når proboscis er fuldt tilbagetrukket.
- Fylde overfladen af platformen med et sukker-fri saltopløsning indeholdende (i mM): NaCl, 140, KCI, 2 MgCl2, 4,5, CaCl2, 1,5 og HEPES-NaOH, 5 med en pH på 7,1 10. Dette saccharose-fri saltopløsning har en lignende tonicitet til dem i almindeligt anvendte saccharose-holdige saltopløsninger, såsom HL3.1 11.
- Åbn hovedet kapsel med en wolfram kniv og pincet med skærpede tips som saks, som er en specialfremstillet enhed og oprindeligt designet af Dr. Kageyuki Yamaoka, Japan, at klippe neglebånd og luftrør for at udsætte SOG (Figur 4). Den ventrale kant af hovedet neglebånd blev klippet så ventrale som muligt mens dorsale kant snit ikke var så kritisk. Først gør et snit gennembageste kant ved hjælp af en wolfram blad. Derefter skære gennem side og de forreste kanter ved hjælp af spidse pincet. Snittet neglebånd stykke skal løftes med pincet og fjernet. Antenner og antennal nerver skal skæres ud af de skærpede pincet.
- For at undgå bevægelse artefakter under optagelser, skal hjernen stabiliseres gennem fjernelse af visse dele af flue. Først selektivt fjerne luft sække mellem SOG og neglebånd. Skåret spiserøret ved enden mod pharynx og ved afslutningen gå i SOG at fjerne forbindelsen mellem pharynx og hjernen. Træk derefter ud Muskel 16 12, og endelig, tag en luftrør forbinder hjernen og neglebånd.
- Vi satte vores FLUER på scenen af et Olympus BX51WI mikroskop forbundet til en roterende disk konfokal mikroskop system (Improvision i PerkinElmer) (figur 5). En vand nedsænkning linse, f.eks 40X/0.8 NA blev neddyppet i badet (fig. 6
3. Ca 2 + billeddannelse af hjernen
- Ca2 +-billeddannelse ved hjælp GCaMP3.0 1, 9 udførtes ved metoden indført ved Marella et al. 8 (fig. 6). Ved hjælp af en roterende skive konfokalt mikroskop (Improvision), en enkelt optisk sektion tage på 4Hz med en eksponeringstid på 122ms anvendelse 491nm excitation laser, der fokuserer på området af interesse (en celle legeme af en motor neuron eller en interneuron eller præsynaptiske terminaler af gustatoriske sensoriske neuroner) med Velocity software, ver. 4,3 (Improvision).
4. Stimulere Proboscis
- Aspirer 100mM vandig saccharose-opløsning i en injektionsnål med en lille væge (fremstillet af japansk Washi papir, se tabel specifikke reagenser) rager frem fra spidsen (figur 7).
- Aflade en lille dråbe saccharoseopløsning på vægen, så aspireres det umiddelbart before anvende gennemvædede Washi papiret væge til spidsen af proboscis. Den Washi papir væge bør kun anvendes for et øjeblik for at undgå mættelse (figur 8). Overvåge Proboscis Extension reaktion (PR) adfærd under anvendelse af et CCD-kamera fastgjort til en dissektion mikroskop (fig. 5) samtidig med Ca2 +-billeddannelse. Data skal tages inden for en time efter start dissektion, fordi PER respons ikke opretholdes mere end en time under disse betingelser.
5. Repræsentative resultater
Motoriske neuroner på talerstolen vinkelmåler, et par af de store muskler, der er ansvarlige for at løfte talerstolen for snabel forlængelse, er blevet rapporteret at vise robuste svar på søde stimuli 13. Figur 9 viser Ca 2 +-signaler gennem GCaMP3.0 1, 9 udtrykkes ved en gal 4 driver, E49 13, fra en celle legeme af motorneuroner. Som vist i videoen, en robust PER blev observeret i takt med en forøgelse i Ca2 +-signal.
Figur 1. Skematisk af Fly hjernen Live-Imaging og Elektrofysiologi Stage (fluer). a, Fluerne opbygget således, at vinklen af væggen muliggør fluen hovedet kommer lige ud. Tre segmenter af fluen snabel er farvekodede, talerstolen er magenta. Fluen indsættes i kammeret med en pincet, og et stykke skæres fra enden af en Pipetman spids er forbundet til bagsiden af kammeret for at blokere fluen undslippe. B er boret hul i overensstemmelse med fluen hoved. De resterende huller er tætnet med lys-hærdende lim som angivet for at sikre, at der ikke er utætheder. Efter limen er hærdet, er Pipetman spidsen som en prop fjernet. Saltvand hældes i FLUER således at overfladen af hjernen er helt dækket. Det skal sikres, at der ikke er nogen saltvand lækagening ud på den forreste ende af flyve hovedet. Det skraverede område omgivet af den punkterede linie i panel b viser den del, der skal dissekeret ud.
Figur 2. Fotografi af fluerne. De korsformede væg lim (fra en limpistol) bringes til at styre strømmen af saltopløsning under perfusion, og for at reducere mængden af saltvand anvendes.
Figur 3. Frontal billede af en flue monteret i fluerne. Dette billede viser, hvordan en flue der er fastsat i de fluer, og hvordan lys-hærdende lim påføres omkring hovedet af fluen (pile) til at oprette en saltvand-forsegling. Hvis nogen saltvand lækager gennem til snabel af fluen, så forsøget mislykkes. Tråden (pilehoveder) bindes til trin er at holde proboscis i position, således at det ikke er helt retrac TED. Ellers ville hindre mere ventrale del af SOG og forårsage bevægelse artefakter.
Figur 4. Top-view af fluerne med en dissekeret flue. Dette billede viser den udsatte SOG af en flue efterfølgende kutikula fjernelse. Spiserøret, Muscle 16 og tracheae forbundet til hjernen, såvel som udvalgte luft-sække er også blevet fjernet for at forhindre dem i at forstyrre hjernen, hvilket kan føre til fejl i calcium signaler.
Figur 5. Overvågningsapparatet. Dette apparat er sammensat af et Olympus-mikroskop BX51WI fastgjort til en roterende skive konfokalt mikroskopsystem (Improvision) og en sidemonteret Nikon SMZ800 mikroskop. Denne opsætning giver mulighed for live-billeder af hjernens aktivitet under PER adfærd.
6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
Figur 6. Fotografier, der viser den set fra siden af fluer. Det tynde lag af saltopløsning er indeklemt mellem 40X vand nedsænkning linsen og flue.
Figur 7. Skematisk for at gøre Washi papiret vægen. Gampi-Washi papir er en traditionel japansk pergament, der er ekstremt tynd og glat (Haibara, Japan). Det er også meget stærk og kan fastholde en stor mængde væske. Den Washi papir skal skæres i en trapez med meget specifikke dimensioner 0,3 mm og 0,7 mm i bredde og 4-5 mm i længde (a). Denne trapez indsættes derefter fra 0,7 mm side ind i spidsen af en 23 G kanyle og kan også stabiliseres ved indsættelse af et insekt tap, som er bøjet til en V-form (b). C, Washi papir bliver transparent efter eksponeringen væske, er det ideelt til dette eksperiment fremstilling.
Figur 8. Stimulering af proboscis på fluer med de Washi-væge. Den Washi papir væge ved spidsen af en kanyle anvendes til stedet med et joystick manipulator med én hånd. Nålen er forbundet via en fleksibel slange til en injektor manipuleret med den anden hånd til opsugning og tømning saccharoseopløsning.
Figur 9. Repræsentative resultater. en, PER adfærd optaget gennem CCD-kamera installeret på stereomikroskop. Frontale afbildninger af en udsultet flue med forlænget proboscis (pile) før stimulering, på stimulering, og efter stimulering med en væge, der indeholder 100 mM sucrose vandig opløsning (pilhoved). Belysning opnås ved en 491 nm anvendte laserfor GCaMP fluorescens. b-Saccharose induceret GCaMP 3,0 reaktion i motor neuron til vinkelmåler af talerstolen muskel i udsultet tilstand. Toppanelet, før stimulering; bundpanelet, umiddelbart efter stimulering. Målestokken, 10 um. C, Kvantificering af saccharose-inducerede GCaMP 3,0 respons. De motoriske neuroner reagerer på en saccharose stimulus af en markant stigning i fluorescens efterfulgt af en genoprettelse fase på flere sekunder til basislinien.
Discussion
Fluerne muliggør samtidig optagelse af Ca2 +-signaler og PR adfærd. Selv med hjernen udsættes for saltvand normal PER adfærd blev observeret. Brug af Gampi-Washi væge i stedet for en Kimwipe væge anvendt i den oprindelige kapillarrøret method7 letter en meget reproducerbar og stabil PER adfærd og undgår behovet for at blive uddannet i at gøre og vælge en god Kimwipe væge. De eksperimentelle spidser anført ovenfor tillod os at kunne undgå forstyrrelser ved bevægelse af proboscis, hvilket fører til en meget stabil optagelse af Ca 2 +-signaler med lav støj. Lejlighedsvis fjernelse af væv ikke var tilstrækkelig til at udsætte celler eller undertrykke bevægelse tilstrækkeligt, hvilket fører til dårlige resultater. Men, når vi var dygtige, mere end 80% af præparater givet gode resultater. Denne metode er ikke blot for Ca2 +-billeddannelse, men kan også tilpasses til alle levende billeddannelse under iagttagelse PER adfærd. For eksempel kan man få adgang til en celle viaanvendelse af en elektrode til direkte optagelse aktivitet. Kombineret med to-foton excitering mikroskopi, er vi i stand til at udføre tidsforløb billeddannelse af synaptisk struktur, som kan relateres til adfærdsændringer. Derfor er denne fremgangsmåde til billeddannelse af hjernen med adfærdsmæssige observationer er ikke kun værdifuld for den funktionelle dissektion af neurale netværk, men kan anvendes som et effektivt middel til at korrelere synaptisk plasticitet 14 til mekanismerne bag hukommelse.
Acknowledgments
Jeg takker L Watanabe, M Gorczyca og andre medlemmer af Yoshihara laboratoriet for nyttige kommentarer og diskussion. Jeg takker K. Scott og L. Looger for flyve aktier, S Yokoyama til demonstration eksperimenter, Shinya Iguchi for teknisk hjælp, og Nobuko Yoshihara for væsentlige oplysninger. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Mental Health Tilskud MH85958, og Worcester Foundation til MY
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
