Summary
Dois métodos distintos para as fábricas de tela com nematóides de galha-são descritos. As abordagens descritas incluem alto rendimento telas com nemátodos de uma maneira não destrutiva para facilitar a utilização destas plantas em programas de criação.
Abstract
Galhas-nematóides (gênero Meloidogyne) são parasitas de plantas obrigatórios. Eles são extremamente polífagas e considerado um dos fitonematóides economicamente mais importantes parasitas. O microscópico segundo estágio juvenil (J2), molted uma vez no ovo, é o estágio infectante. Os J2s eclodem dos ovos, mover-se livremente no solo dentro de uma película de água, e localizar pontas de raízes das espécies de plantas adequadas. Após penetrar a raiz da planta, eles migram em direção ao cilindro vascular onde estabelecer um local de alimentação e iniciar a alimentação de seus estiletes. O local de alimentação multicelular é composto por vários ampliadas células multinucleadas chamados 'células gigantes' que são formados a partir de células que foram submetidos a karyokinesis (repetido mitose) sem citocinese. Periciclo células vizinhas dividir e ampliar em tamanho dando origem a uma vesícula típica ou nó raiz, o sintoma característico da raiz nó-infecção por nematóides. Uma vez que a alimentação é iniciada, tornar-se sedentário e J2s undergo três mudas adicionais para se tornarem adultos. A fêmea adulta estabelece 150-250 ovos em uma matriz gelatinosa em ou abaixo da superfície da raiz. A partir dos ovos eclodem J2s infecciosos novos e iniciar um novo ciclo. A raiz-nó ciclo de vida do nematóide é completado em 4-6 semanas a 26-28 ° C.
Aqui nós apresentamos o protocolo tradicional de infectar plantas, cultivadas em vasos, com galhas-nematóides e dois métodos de ensaios de alto rendimento. O método de alto rendimento primeira é usada para plantas com sementes pequenas, como tomate, enquanto o segundo é para as plantas com sementes grandes, como feijão caupi e comum. Sementes grandes apoiar o crescimento das mudas estendida com suplemento nutricional mínimo. O ensaio de taxa de transferência de alta primeiro utiliza plântulas crescidas em areia em bandejas, enquanto nas plantas segundo ensaio são cultivadas em bolsas, na ausência de solo. A bolsa de crescimento de plântulas é feita de um pavio 15,5 x 12,5 centímetros de papel, dobrada na parte superior para formar uma calha 2-centímetros de profundidade na qual as sementes ou plântulas é colocado. Opavio de papel está contido dentro de uma bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crescimento permitir a observação directa dos sintomas de infecção, de nematóides das raízes galhadores e produção em massa de ovo, sob a superfície de uma bolsa transparente. Ambos os métodos permitem a utilização das plantas rastreados, após fenotipagem, para a passagem ou de produção de sementes. Uma vantagem adicional da utilização de bolsas de crescimento é o requisito de espaço pequeno, porque são armazenados em bolsas de plástico pastas penduradas dispostos em prateleiras.
Protocol
1. Crescimento de mudas de tomateiro em vasos e bandejas
- Para experimentos em vasos, sementes de plantas de tomate em um único vaso em um solo orgânico rico, como mix de sol. Manter em casa de vegetação, 22-28 ° C. Após a germinação, adubar uma vez por semana com Miracle-Gro.
- Aproximadamente duas semanas após a germinação, a fase dois verdadeiro-folha, transplantar individualmente as plântulas em panelas (10 cm de diâmetro e 17 cm de profundidade) cheios com solo arenoso estéril contendo areia 90% e 10% mistura orgânica. Adicionar Osmocote fertilizante de liberação lenta e manter em estufa a 22-28 ° C durante duas semanas. Continue para fertilizar plantas uma vez por semana com Miracle-Gro.
- Para telas de alto rendimento, plantar sementes diretamente em bandejas em solo arenoso, cobrir a bandeja com filme plástico até a germinação e manter como acima. Após a germinação, adicione Osmocote fertilizante de liberação lenta e adubar uma vez por semana com Miracle-Gro.
2. Cowpea Crescimento em bolsas de plântulas
- Seeds ou são germinadas em uma placa de Petri, revestidas com várias camadas de papel Kimwipe, e transferidos separadamente para bolsas ou colocado directamente dentro da ranhura de papel da bolsa e germinadas.
- Coloque os malotes em uma pasta de arquivo de plástico pendurado, dois por pasta e organizar as pastas em um rack na posição vertical. Coloque a cremalheira numa câmara de ambiente controlado mantida a uma temperatura de 25-28 ° C e luz 16 h / 8 de ciclo h escuro. Cremalheiras também podem ser mantidas em uma estufa, mas requerem uma folha metálica ou papel duro tampa colocada sobre a cremalheira em ambos os lados das hastes de plantas, para reduzir o potencial de contaminação por fungos.
- As bolsas de água uma vez ou duas vezes por dia, com água de osmose inversa. Cerca de 10 a 14 dias após a semeadura, quando um sistema de raiz adequada com pontas de raízes terciárias desenvolveu (Figura 1), as mudas estão prontas para inoculação.
3. Extração de ovos de nematóides
Extração de eGGS de raízes infectadas é modificado a partir de um protocolo desenvolvido por Hussey e Barker (1973).
- Três a quatro dias antes da inoculação do nematóide, extrair ovos galhas-nematóides das raízes de tomate infectadas. Antes de iniciar a extracção de ovo, lavar a área de trabalho completamente com água quente para evitar a contaminação. Também lavar em água quente a. Liquidificador, dois baldes, um suporte de malha de arame, um martelo de borracha, três peneiras de 425, 90 e 25 mM de abertura, uma proveta graduada e tesoura
- Empilhe as peneiras de cima para baixo na seguinte ordem: 425, 90 e 25 mM de abertura. Os ovos serão recolhidos no peneiro de 25 uM na parte inferior. Coloque as peneiras em uma malha de arame apoiada em uma pia. Coloque um balde sob a malha de arame para coletar a solução run-through.
- Cortar os topos da planta infectada (s), utilizados como a fonte do inoculo, e descartar. Retire cuidadosamente a planta do vaso. Lavar as raízes, por imersão em um balde de plástico cheio de água. Lavar as raízes mais em executarning água até que as partículas do solo são lavados a partir das raízes.
- Corte as raízes com uma tesoura em pedaços pequenos. Descarte a raiz principal.
- Coloque as raízes cortadas a partir de uma única planta em uma jarra de plástico grande com tampa, adicione apenas o suficiente solução de lixívia a 10% para cobrir as raízes e feche a tampa.
- Agitar o frasco contendo as raízes durante 2 min.
- Abra o frasco e despeje as raízes para o peneiro superior e lavar com uma mangueira ligada a um bocal de nebulização. Lave bem até que todo o cheiro a lixívia se foi. Use um martelo para apertar os lados das peneiras para evitar o entupimento dos poros de peneira.
- Remover o peneiro superior e enxaguar os detritos no peneiro segundo.
- Remover o segundo crivo e recolher os detritos fina, que inclui os ovos, a partir do peneiro última. Com uma ligeira corrente a partir de uma garrafa de água, mover os detritos para um lado da peneira. Recolher os detritos e de ovos para um copo de limpa com uma quantidade mínima de água.
- Peneira mais uma vez a água coletada nobalde através da peneira 25 mM de recolher todos os ovos que podem ter escapado. Lave bem com água e recolher no mesmo copo.
- Descarte a restos de plantas do peneiro superior e lavar cuidadosamente as três peneiras com água pressurizada. Não toque na parte de malha dos peneiros como pode distorcer o tamanho dos poros.
4. Nematóides de ovos para incubação
- Forre uma cesta de metal limpo, com algumas camadas de papel Kimwipe e caber em uma placa de Petri de vidro. Permitir uma distância de 1 cm entre o fundo do cesto eo prato.
- Verter os ovos de nematóides extraídos para o papel no cesto de arame. Adicionar líquido suficiente de modo que o fundo do cesto de arame toca a superfície da água, mas não está imerso na água. Cobrir a parte superior com uma tampa de plástico.
- Cada dia verificar para a evaporação da água e adicionar um pouco de água numa placa de Petri de modo que o fundo do cesto toca a água. Isso vai evitar que os ovos sequem.
- A cada dois dias, recolher o water que contém os J2s das placas de Petri para um copo. Se não for utilizado imediatamente, ventilar o inoculo recolhidos à temperatura ambiente utilizando uma fonte de ar do laboratório ou de ar gerada por uma bomba de aquário. Utilizar o inóculo gaseificado dentro de 2 dias. J2s podem ser recolhidos a partir da incubação definido ao longo de um período de 6-8 dias.
5. Infecção tomate Root em vasos ou bandejas e avaliação de infecção
- Use três alíquotas dos nemátodos recolhidos para contar o número de J2s em uma corrediça de contagem ou prato, calcular a média e determinar o volume desejado para inoculação. Tipicamente 3000 J2s são usados por plantas em vasos e 500 J2s para plantas cultivadas em substrato.
- Agita-se o inoculo sobre uma placa de agitação magnética a baixa velocidade.
- Antes de inocular as plantas, certifique-se que o solo está úmido, mas não muito molhado. Para inoculação panela, faça três furos de cerca de profundidade de meio pote na areia ao redor de cada sistema radicular de tomate usando um lápis (Figura 2
- Para as telas de alto rendimento em bandejas, utilizar uma ponta da agulha modificado fechado, com orifícios nos lados coladas a uma ponta de pipeta de 5 ml ao longo de uma pipeta (Figura 3) para entregar os J2s no solo. Alternativamente, os nemátodos podem ser entregues como no passo 5.3.
- Manter as plantas em uma estufa em 24-27 ° C por seis a oito semanas. Continue para fertilizar duas vezes por mês com Miracle-Gro.
- Para a avaliação da infecção, cuidadosamente remover as plantas dos vasos e lavar as raízes (como descrito no passo 3.3).
- Stain as massas de ovos azuis por submersão das raízes em 1 mg / L erioglaucine, durante 15 min.
- Lavar as raízes em água e avaliar através da contagem de massas de ovos manchados no sistema radicular individual. Um ampliador iluminado mesa pode ser usada para ajudar a visualizar as massas de ovos.
- Se as plantas crivados são necessários para g ainda maisestudos enetic, não corte os topos antes da lavagem, as raízes para avaliação. Após coloração e contando as massas de ovos, o transplante de mudas em solo orgânico, podar as copas fortemente para reduzir a transpiração, e manter em uma estufa.
6. Cowpea Infecção Root em Bolsas e avaliação de infecção
- Contar o inoculo de nemátodos e agita-se sobre uma placa de agitação magnética, tal como descrito anteriormente.
- Remova as bolsas das pastas suspensas e coloque sobre uma superfície horizontal. Inocular cada bolsa com 1500 J2s em 5 ml. Levantar a tampa de plástico da bolsa e distribuir os nemátodos uniformemente sobre a superfície das raízes.
- Manter as bolsas numa posição horizontal durante 24 h após a inoculação, coberto com papel escuro para eliminar a luz, e depois voltar para as pastas de suspensão na câmara de crescimento.
- De água das plantas, conforme necessário, uma ou duas vezes por dia, com metade da força-solução de Hoagland (Hoagland & Arnon, 1950; Tabela 1
- Aproximadamente 30 dias (intervalo de 28-35 dias) após a inoculação, infundir cada bolsa com cerca de 10-20 ml de 75 erioglaucine mg / L. Manter as bolsas inundadas com o corante numa posição horizontal durante a noite.
- Escorra as bolsas e avaliar os sistemas radiculares através da contagem de massas de ovos em um amplificador de mesa iluminada.
- Se as plantas blindados são necessários para estudos genéticos ou de trabalho de criação, cuidadosamente puxe as raízes do papel do transplante, em solo orgânico em vasos e manter em uma estufa.
7. Os resultados representativos
As fases adequadas do tomate e caupi plantas para as inoculações de nematóides, para os dois sistemas descritos são mostrados nas Figuras1 e 2. Além disso, exemplos de bem-infectadas raízes de tomate e caupi são mostrados nas Figuras 4 e 5. Tal como na maioria das telas de resistência à doença, é aconselhável a utilização de pelo menos 6-10 plantas por genótipo para a inoculação de nemátodos para calcular a média da taxa de infecção. Variação da infecção por nematóides entre as plantas, do mesmo genótipo, pode ser reduzido pelo uso de tamanho uniforme e planta quantidade exacta e entrega de inoculo.
A utilização de tabuleiros e bolsas de crescimento permite rastreio de centenas a milhares de plantas em um espaço pequeno crescimento. Bolsas de crescimento também permitem rápido e eficiente de avaliação não destrutiva de infecções galhas-nematóides sem a necessidade de raízes de lavagem (Figura 4).
Figura 1. A duas semanas de idade, planta caupi cultivado em uma bolsa e pronto para o root-knot nemaTode inoculação.
Figura 2. A três plantas de tomate semanas de idade, pronto para galhas-inoculação do nematóide.
Figura 3. Uma agulha modificado e utilizado para ponta de pipeta de alto rendimento inoculação de nematóides. A parte inferior de uma agulha foi selado e três conjuntos de furos foram perfurados na agulha usando um feixe de laser. Em seguida, a agulha modificado foi colada a uma ponta de pipeta de 5 ml.
Figura 4. Um sistema radicular de tomateiro com galhas-nematóides.
Figura 5. Um sistema radicular caupi com massas de ovos corados com erioglaucine 30 dias pós-inoculação crescido a28 ° C.
Discussion
Há dois passos essenciais para uma tela de nematóide de sucesso: preparação de um inóculo altamente infecciosa e uso de plantas na fase adequada de desenvolvimento. Taxa de eclosão de ovos de nematóides de galha-é altamente variável e varia entre 5 - 50%. Portanto, para obter níveis ótimos de escotilha e J2s altamente infecciosa, atenção deve ser dada para a extração de ovos para incubação e procedimentos. Ovos deve ser exposto a lixívia por um período mínimo de tempo e de lixívia deve ser lavado para fora a partir da mistura bem de raiz. Quando a eclosão dos ovos, a lama contendo os ovos não deve ser mergulhado em água. Além disso, evitar derramar os ovos em uma placa de Petri subjacente, onde os jovens nascidos são coletados. Uma maneira de evitar o derramamento dos ovos durante o processo de incubação não é adicionar água diretamente ao Kimwipe como o papel pode quebrar. Em vez adicionar a água directamente para a placa de Petri.
Para melhores resultados, use J2s recém-nascidos. Se o hatctaxa h é baixa e mais inoculo é necessário, J2s pode ser armazenado a 15 ° C durante um período mais longo. Aquecer o inoculo armazenado à temperatura ambiente para recuperar os nematóides antes da inoculação. No entanto, não armazenam os J2s durante períodos prolongados, mesmo a 15 ° C como J2s starved não irá infectar de forma eficiente.
Mudas jovens são o melhor estágio de desenvolvimento de galhas-inoculação do nematóide. No entanto, este tem de ser equilibrada com a formação de um sistema de raiz adequada que permita um número suficiente de pontas de raízes como pontos de entrada para os J2s. Manter condição de crescimento ideal das plantas é também crítico para as telas. Evitar o excesso de rega-plantas, especialmente aquelas cultivadas em bolsas. Mais-molhar as bolsas, como indicado por pé de água no fundo da bolsa, pode promover o crescimento de fungos e diminuir a saúde da raiz.
Com ambos os ensaios de avaliação subsequente da infecção de nematóides e cálculo do número de ovos / sistema radicular e ovos / grama de freraiz sh pode ser realizada. Para os ensaios de tomate, raízes individuais são pesados e de ovos extraídos como descrito para a preparação de inóculo (secção 3). Quando o processamento grande número de amostras de plantas, sistemas de raízes individuais poderiam ser macerada usando um misturador para a extracção de ovo. O número de ovos devem ser contadas em pelo menos três alíquotas e os ovos / grama de sistema de raízes frescas calculado. Para os ensaios de bolsa, o sistema da raiz é puxado para fora do inserto de papel, pesados, e os ovos extraído.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa em Kaloshian laboratório é financiado por uma concessão dos Estados Unidos Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (2007-35607-17765). Pesquisas em laboratório Roberts é financiado por doações da Agência dos Estados Unidos para Desenvolvimento Internacional (GDG-G-00-02-00012-00 e EDH-A-00-07-00005) e da Califórnia feijão Conselho Consultivo.
References
- Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway. Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).
- Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea. Crop Sci. 40, 611-618 (2000).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).
- Hussey, R. S., Barker, K. R. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).
- Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid. Plant J. 27, 417-425 (2001).
- Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).
- Omwega, C. O., Roberts, P. A. Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature. Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).
- Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita. Plant Dis. 72, 970-972 (1988).
- Perry, R. N. Root-Knot Nematodes. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).
- Starr, J. L., Cook, R. Resistance to Parasitic Nematodes. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
