Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Infektion af zebrafisk embryoner med intracellulære bakterielle patogener

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Gennemsigtige zebrafisk embryoner har vist sig nyttig model værter til at visualisere og funktionelt studie samspil mellem medfødte immunceller og intracellulære bakterielle patogener, såsom

Abstract

Zebrafisk (Danio rerio) embryoner anvendes i stigende grad som en model til at studere funktionen af hvirveldyr medfødte immunsystem i værtspatogene interaktioner 1. De større celletyper i det medfødte immunsystem, makrofager og neutrofiler, udvikles under de første dage af embryogenese før modningen af ​​lymfocytter, der kræves for adaptive immunrespons. Den lethed at opnå et stort antal af embryoner, deres tilgængelighed på grund af ekstern udvikling, optisk transparens af embryonale og larvestadier, en bred vifte af genetiske værktøjer, omfattende mutant ressourcer og samlinger af transgene reporter linier, bidrager til den alsidighed zebrafisk model. Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) og Mycobacterium marinum kan opholde intracellulært i makrofager og anvendes ofte til at undersøge værtspatogene interaktioner i zebrafisk embryoer. Infektionen processer af disse tobakterielle patogener er interessant at sammenligne, fordi S. typhimurium infektion er akut og dødbringende inden for én dag, mens M. marinum infektion er kronisk og kan afbildes op til larvestadiet 2, 3. Stedet for mikro-injektion af bakterier i embryoet (fig. 1) bestemmer, om infektionen hurtigt bliver systemisk eller vil indledningsvis blive lokaliseret. En hurtig systemisk infektion kan etableres ved mikro-injektion bakterier direkte ind i blodbanen via halevenen ved den bageste blodet ø eller via kanalen af ​​Cuvier en bred udsendelse kanal på blommesækken forbinder hjertet til stammen vaskulatur. Ved 1 dpf, er, når embryoner på dette tidspunkt har phagocytically aktive makrofager, men neutrofile har endnu ikke modnet, indsprøjtning i blodet øen foretrækkes. For injektioner på 2-3 dpf, når embryoner også have udviklet funktionelle (myeloperoxidase-producerende) neutrofiler, kanalen af ​​Cuvier foretrækkes som tHan injektionsstedet. At studere rettet migrering af myeloide celler mod lokale infektioner, kan bakterier injiceres i halen muskel, otiske vesikel eller baghjerne ventrikel 4-6. Desuden rygstrengen, en struktur, som synes at være normalt utilgængelige for myeloide celler er meget modtagelige for lokal infektion 7. En egnet alternativ til high-throughput anvendelser er injektion af bakterier i blommen af embryoner i de første timer efter befrugtning 8. Kombinere fluorescerende bakterier og transgene zebrafisk linjer med fluorescerende makrofager eller neutrofiler skaber ideelle forhold for multi-farve scanning af vært-patogen interaktioner. Denne video artikel vil beskrive detaljerede protokoller for intravenøs og lokal infektion af zebrafisk embryoner med S. typhimurium eller M. marinum bakterier og til efterfølgende fluorescensimagografi af interaktionen med celler i det medfødte immunsystem.

Protocol

1. Forbered Injektionsnåle

  1. Forbered borsilicatglashulsfærer mikrokapillær kanyler (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm OD x 0,78 mm ID) ved hjælp af en mikropipette aftrækker enhed (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown p-97 med følgende indstillinger for en længere tip: lufttryk 400; varme 610, træk 40, hastighed 50, tid 30 og med følgende indstillinger for en kortere tip: lufttryk 500, varme 510, træk 100, hastighed 200; tid 60).
  2. Bræk nålespidsen med fine pincet til at opnå en spids åbning diameter på 5-10 um. Det er tilrådeligt at affase nålespidsen åbningen i en 45 graders vinkel med microgrinder (Narishige Inc., EG-400) til opnåelse af en skarpere spids. Dette vil lette punktering af epidermislaget og således resultere i mere reproducerbare injektioner med mindre vævsbeskadigelse end med stumpe nåle. Længere tippes nåle foretrækkes til halevenen (trin 5) og kanal Cuvier (trin 6.1) injektioner og kortere spidser nåleforetrækkes til de andre injektion protokoller (trin 6.2-6.6).

2. Forbered S. typhimurium Inoculum

  1. Plate ud S. typhimurium fra en -80 ° C glycerolstamopløsning på LB-agarplader (med passende antibiotika til selektion af fluorescens ekspressionsvektorer) og inkuberes natten over ved 37 ° C.
  2. Pick individuelle fluorescens positive kolonier, og resuspender dem til den ønskede koncentration (se protokoller 5 og 6) i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS), eventuelt indeholdende 0,085% (v / v) phenolrødt (Sigma-Aldrich) for at hjælpe visualisering af injektionsprocessen. Direkte bruge den friske suspension til injektion eller forberede glycerol lagre. Til fremstilling af glycerol lagre dreje ned frisklavet injektion lager med den ønskede koncentration af bakterier og koncentreres bestanden ved at resuspendere pelleten i halv udgangsvolumenet i steril 20% (v / v) glycerol (Sigma-Aldrich) i PBS. Opbevar glycerol bestanden ved -80 ° C. Fortynd glycerollage 1:1 (v / v) før injektion i sterilt PBS, eventuelt indeholdende 0,17% phenolrødt.
  3. Vortex bakteriesuspensionen godt for at undgå klumper.
  4. Læg inokulum i mikrokapillær nålen ved hjælp af en microloader spids (Eppendorf, 5242956,003).
  5. På grund af den relativt store størrelse af S. typhimurium bakterier og deres lyse Ds-rød fluorescens, når du bruger pGMDs3 ekspressionsvektor 3 (stamme kan rekvireres), kan den enkelte bakterieceller let blive talt med en fluorescens stereomikroskop med henblik på at indstille injektionsdosis. Til dette formål, 1 Nl injicere en dråbe PBS på en agarplade, tælle de fluorescerende bakterier, og beregne injektionsvolumen, der er nødvendig for at opnå den ønskede bakterie dosis (fortrinsvis holde injektionsvolumen mellem 1-2 NL). Injicer embryoner med S. typhimurium via den valgte rute (se protokoller 5 og 6).

3. Forbered

  1. Hold M. marinum stamme vokser på Difco Middlebrook 7H10-agar (BD and Company) suppleret med 10% oleinsyre-albumin-dextrose-katalase (OADC, BD and Company), 0,5% glycerol og med passende antibiotika til selektion for fluorescens ekspressionsvektorer (stammer er tilgængelige efter anmodning 9), er så der altid er en frisk bestand.
  2. Vælg en koloni af M. marinum og resuspender den i Difco Middlebrook 7H9-bouillon (BD and Company) suppleret med 10% albumin-dextrose-katalase (ADC, BD and Company) og 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) og de ​​passende antibiotika. Kontroller, at den optiske densitet (OD) ved 600 nm er 0,2 - 0,3 og lad det vokse statisk natten over ved 28,5 ° C. Den generation tid M. marinum er ca 4-6 timer, varierer alt efter belastningen.
  3. Måle OD ved 600 nm igen på dag for injektioner. En OD600 på 1 svarer til cirka 10 8 M. marinum / ml(Dette kan variere afhængigt af den anvendte bakteriestamme, og derfor bør være baseret på en vækstkurve for den pågældende stamme).
  4. Harvest bakterierne når de er i logaritmisk fase (lad ikke OD600 overstige 1,00) ved centrifugering og vask dem tre gange i sterilt PBS.
  5. Måle OD600 igen af ​​den bakterielle suspension i PBS, vågeblus, og resuspender bakterierne til den ønskede koncentration (se protokoller 5 og 6) i PBS eller 2% polyvinylpyrrolidon (PVP40) i PBS (v / v), hvilket forbedrer homogeniteten af den bakterielle suspension. Phenolrødt (Sigma-Aldrich) kan tilsættes til en koncentration på 0,085% til støtte visualisering af injektionsprocessen. Direkte bruge den friske suspension til injektion eller forberede glycerol lagre. Til fremstilling af glycerol lagre dreje ned frisklavet injektion lager med den ønskede koncentration af bakterier og koncentreres bestanden ved at resuspendere pelleten i halv udgangsvolumenet i steril 20% glycerol i PBS. Opbevar GlycErol lager ved -80 ° C. Fortynd glycerollage 1:1 (v / v) i sterilt PBS, eventuelt indeholdende 4% PVP40 og / eller 0,17% phenolrødt.

4. Forbered zebrafisk embryoner til injektioner

  1. Opsætning zebrafisk ynglepar og indsamle embryoner, som vist i en anden video artikel 10. Holde embryoer i en petriskål fyldt med æg vand (60 ug / ml havsalt. Ca 60 embryoner / skål) og inkuberes ved 28,5 ° C.
  2. Om nødvendigt tilsættes 0,003% N-phenylthiourea (PTU, Sigma-Aldrich) til ægget vand, når de embryoner cirka 12 HPF at forhindre melanin.
  3. Omkring 24 timer efter befrugtningen (HPF), dechorionate embryonerne med fine pincet (Fin Science Tools Inc., Dumont # 5 Tang - Inox Biologi.
  4. Holde embryoer i en petriskål fyldt med æg vand og med et lag af 1% agarose i bunden for at forhindre embryoer fra at klæbe til plastoverfladen.
  5. Bedøve embryoner med 200 ug / ml pufret 3-Aminobenzoesyre (Tricaine, Sigma-Aldrich) cirka 10 minutter før injektion.

5. Intravenøs injektion af bakterier i en dag gamle embryoer

  1. Stage embryoner ved 28 HPF 11 ved at kontrollere for konsekvent blodcirkulationen, begyndelsen af pigmentering i øjet, en lige hale, og hjertet er placeret lige ventralt for øjet.
  2. Bedøve embryoner, se trin 4,5.
  3. Indlæse nålen med det bakterielle inokulum under anvendelse af en microloader spids.
  4. Monter belastede nålen på en mikromanipulator (Sutter Instrument, MM-33) er forbundet med en stand (World præcisionsinstrumenter, M10L magnetisk fod), og placer det under et stereomikroskop (Leica M50, achromat 1x mål 0,15 NA, lys bund TL ST). Indstil injektion tid til 0,2 s og den kompensation, tryk til 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). Juster indsprøjtningstryk mellem 700 og 900 hPa at opnå den korrekte injektionsvolumen for nålenanvendes. Justere dråbestørrelse at matche den ønskede diameter ved hjælp af en skala bar på et objektglas, eller i det okulære. For størrelsesbestemmelse dråben kan injiceres i mineralolie på et objektglas, eller størrelsen kan estimeres ved at injicere luft, som forlader dråbe hænger på nålespidsen. Radius af en dråbe af en nL er 0,062 mm (V = 4/3 π R3).
  5. Indstilles mikromanipulator med den fyldte nål ind i den korrekte position forud for injektion (dvs. omtrent i en 45 ° vinkel i forhold til injektionen pladeoverfladen) og kun bevæge den frem og tilbage til indsprøjtning.
  6. De bedøvede embryoer pipetteres over på en flad 1% agarose intravenøs plade og overskydende æg vand fjernes, så overfladespænding til at holde æg på plads under injektioner. Brug et hår løkke værktøj (fig. 2) at line op embryoner. Orient injektionen pladen med hånden under injektioner at placere embryoner til den foretrukne position for inserting nålen, dvs med deres haler peger mod nålespidsen.
  7. Placere nålespidsen direkte over den caudale vene tæt på urogenitale åbning (figur 1A), gennembryde periderm med nålespidsen og injicere den ønskede dosis af bakterier; vi bruger ca. 250 cfu af S. typhimurium vild type (wt) stamme SL1027, der indeholder Ds-RED ekspressionsvektor pGMDs3 og ca. 120 cfu af M. marinum stammen Mma20. Den injicerede bakteriesuspension følger blodstrømmen gennem halevenen til hjertet. Overvåge hvis injektionen blev udført korrekt, ved at kontrollere for en større mængde af det vaskulære system umiddelbart efter impulsen 2. For dosis-respons eksperimenter, kan 2-3 på hinanden følgende injektioner udføres uden ekstraktion af nålen.
  8. Ofte kontrollere, at injektionsvolumen forbliver den samme under eksperimentet. At give en kontrol for sammenhæng mellem de injektioner gennem hele forsøget, indsprøjte en DROp af bakterier direkte ind i en steril PBS dråbe på bakterievækst medium efter omtrent hver 30. embryo injektion. Plade af denne dråbe, og tæl bakterielle kolonier efter inkubation for at bestemme kolonidannende enheder (cfu) i injektionsvolumen.
  9. Brug en fluorescens stereomikroskop (protokol 7) at observere individuelle fluorescerende S. typhimurium-celler cirkulerer i blodbanen umiddelbart efter injektion, og kassere embryoer, der ikke korrekt injiceret. Individuelle fluorescerende M. marinum bakterier ikke kan observeres ved stereo fluorescens mikroskopi umiddelbart efter injektioner, men fluorescerende aggregater af inficerede celler skal være synlig med 2 dage efter infektion (dpi), og vokse sig større over tid.

6. Alternative smitteveje

  1. Duct af Cuvier injektion: line up bedøvede embryoner (2-3 DPF) på et fladt 1% agarose injektion plade som for caudalvenen injektioner (se 5,6). Vend injicereion plade med hånden under injektioner til at placere de embryoner i den foretrukne position for kanylen, dvs diagonalt under en vinkel på 45 °, således at kanalen i Cuvier kan anskues ved nålespidsen fra den dorsale side af embryo (fig. 1B) . Indsæt kanylen i udgangspunktet af kanalen i Cuvier blot dorsal til det sted, hvor kanalen begynder at udvide i blommesækken og injicer 100-200 bakterier 1-3 NL). Injektion er korrekt, hvis volumenet inden i kanalen udvider direkte efter impulsen og blommesækken ikke brister. Med hensyn til halevenen injektioner (se 5.7), kan flere på hinanden følgende injektioner udføres uden ekstraktion af nålen.
  2. Baghjerne ventrikel injektion: line up bedøvede embryoner (32 HPF) på en flad 1% agarose indsprøjtning plade, sådan at embryonerne er placeret med deres dorsalsiden mod nålespidsen. Stik nålen ind i baghjerne hjertekammer fra en anterior stilling uden at røre neuroepithelium (figur 1C) og injicer 20-100 bakterier (0,5-1 NL). At praktisere fremgangsmåden, anvendes et fluorescerende farvestof (såsom Texas-Red Dextran) som vist i en anden video artiklen 13.
  3. Hale muskel injektion: position bedøvede embryoner (1-2 DPF), som for caudalvenen injektioner (se 5,6). Justere mikromanipulator med den fyldte nål i en vinkel på omkring 65 ° i forhold til injektionen pladeoverflade. Injicere en bakteriesuspension (0,5-1 nL) indeholdende 20 til 50 cfu i musklen over urogenitale åbningen (figur 1D) uden at forårsage skade på rygstrengen eller blodkar.
  4. Otisk vesikel injektion: position bedøvede embryoner (2-3 DPF) som for caudalvenen injektioner (se 5,6). Justere mikromanipulator med den fyldte nål i en vinkel på omkring 65 ° i forhold til injektionen pladeoverflade. Injicer cirka 20 bakterier (0,5 nL) i otisk vesikel (fig. 1E) med lav trykure at undgå lokale væv sprænges.
  5. Rygstreng injektion: line up bedøvede embryoner (1-2 DPF) på en flad 1% agarose indsprøjtning plade, sådan at embryonerne er placeret med deres hale peger væk fra nålespidsen. Kanylen gennem halen muskelvævet i rygstrengen (fig. 1F) og injicer omkring 20-50 bakterier (maksimal 0,5 NL). Pas på ikke at injicere for meget volumen for at undgå brud på rygstrengen.
  6. Yolk injektion: position æg indeholder embryoner på 16 til 1000 celle scenen på en 1% agarose indsprøjtning plade med rektangulære eller V-formede kanaler, lavet med en kanal formen 12 eller online på http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Gennembore nålen gennem chorion i midten af blommen (fig. 1G) og injiceres 20-40 bakterier (1-2 NL). Anvendelse af 2% PVP40 bæreropløsning til bakteriesuspensionen (se trin 3.5)er vigtigt at forhindre tidlig bakteriel spredning i embryoet.

7. Stereo Imaging af infektion

  1. Bedøver de inficerede fostre i en 1% agarose lag petriskål dækket med æg vand tilsat Tricaine (se 4,5).
  2. Bringe embryoner i den korrekte position for billeddannelse under et fluorescens stereomikroskop med hår sløjfe værktøj (figur 2). Før svømmeblæren har oppustet (1-5 dpf), vil de embryoner ligge fladt på deres sider så set fra siden billeddannelse.
  3. Hvis en anden position end den sidebillede er påkrævet, monteres embryoner i 1,5% methylcellulose. Manipulere foster til den ønskede stilling med en hår sløjfe værktøj (figur 2).
  4. Returnér embryoner til ægget vand efter billeddannelse.

8. Konfokal afbildning af infektion

  1. Placere en dråbe af agarose med lavt smeltepunkt (Lonza Inc., 1,5% (w / v) i æg vand) på glasset bunden af ​​enWillCo-fad (WillCo Wells, GWSt-5040), hvis en omvendt konfokal mikroskop bruges, eller på et enkelt hulrum depression slide (Agar Scientific, L4090), hvis en opretstående konfokal mikroskop anvendes.
  2. Placere anæsteseret embryoet i agarosen dråbe med begrænset mængde æg vand og manipulere embryoet i position med et hår sløjfe værktøj (figur 2). Ved anvendelse af et inverteret mikroskop, er det vigtigt, at fosterets regionen af ​​interesse ligger fladt mod glasset bunden af ​​det billeddannende skålen. En opretstående mikroskop kan anvendes i kombination med nedsænkning i vand eller langdistance tørre mål og embryoet skal placeres således, at området af interesse er så tæt på målet som muligt.
  3. Lad agarose størkne og nedsænkes agarose fald i æg vand, som indeholder Tricaine (se 4,5). Hvis en opretstående mikroskop anvendes, anbringes en dækglas oven på depression hulrummet (ikke tillader at der dannes luftbobler).
  4. Sekventielt erhverve influenzaorescence og transmission billeder.
  5. Fjern forsigtigt agarose fra foster med fine pincet og placere fosteret tilbage i ægget vand, hvis det er nødvendigt for yderligere eksperimenter.

9. Repræsentative resultater

Injektion af Salmonella typhimurium eller Mycobacterium marinum bakterier i blodet ø embryoer på 1 dpf resulterer i den hurtige phagocytose med makrofager. MPEG1 genet er for nylig blevet identificeret som en trofast markør af embryonale makrofager, colocalizing med veletablerede makrofag markør csf1r (FMS) og ikke overlappende med neutrofile markører såsom MPX (MPO) og lyz 4, 14. Til direkte visualisering af bakteriefagocytose anvendte vi transgene linier, som MPEG1 promotor driver fluorescerende protein ekspression i makrofager 14. Disse transgene linier enten have MPEG1 promotor fanvendes direkte til GFP-genet, eller anvende et to-komponentsystem, hvor MPEG1 promotoren driver ekspression af gær-Gal4 transcription faktor, som aktiverer en anden transgen med Gal4-genkendelsessekvensen (UAS, opstrøms aktiverende sekvens) fusioneret til KAEDE genet. Når blodet øen injektion (protokol 5, figur 1A) udføres korrekt, vil bakterierne straks flyde gennem blodcirkulationen og spredt over hele embryoet. Spredning af relativt store og stærkt fluorescerende Ds-RED mærket S. typhimurium bakterier kan afbildes direkte med en stereo fluorescensmikroskop (figur 3A) og konfokal billeddannelse ved 2 HPI viser, at mange bakterier fagocyteret af fluorescerende makrofager (figur 3B-C). Injektion af så lidt som 25 cfu af vildtype S. typhimurium bakterier vil resultere i en dødelig infektion, medens en tilsvarende dosis af bakterier af en avirulent stog, som Ra, kan fjernes ved den embryonale immunsystemet 3. En injektion dosis på 250 cfu blev anvendt til at bestemme transkriptionelle reaktioner S. typhimurium infektion i zebrafisk embryoet og viste induktion af en stærk proinflammatorisk genekspression respons 15. I modsætning hertil intravenøs injektion af M. marinum bakterier ikke fremkalde en stærk pro-inflammatorisk respons, men fører til en vedvarende infektion, hvor inficerede makrofager dannelse stramme aggregater, der betragtes som de indledende stadier af granulomer, som er kendetegnende for tuberkulose 2. Konfokal afbildning af et sådant granulom-lignende aggregat i Tg (MPEG1: EGFP) gl22 linie 14 til 5 dpi viser den intracellulære vækst af mCherry-mærket M. marinum bakterier inde i grønt fluorescerende makrofager (figur 3D-E).

Othendes smitteveje er nyttige til forskellige formål. Bakterier kan injiceres i baghjerne ventrikel ved 32 HPF (figur 1C), som er et rum uden makrofager. Injektion på 20-100 mCherry-mærket M. marinum bakterier i dette rum fører til hurtig infiltrering af makrofager, at fagocytose bakterier (figur 4A). En anden metode til at studere rettet migrering af medfødte immunceller er injektion af bakterier i halen musklen (figur 1D). Imidlertid hale muskel injektioner også forårsage vævsskade, der i sig selv fremkalder en tiltrækning af leukocytter. Et sådant såring respons kan undgås ved omhyggeligt at injicere en lille mængde (0,5-1 nL) i otisk vesikel (fig. 1E). Som vist her ved hjælp af Tg (MPX: EGFP) i114 linie 16, injektion af cirka 20 cfu af S. typhimurium i otiske vesikel fører til tiltrækning af neutrofile ved 3 HPI ( (fig. 4E). Rygstrengen, som synes at være resistent over for infiltrering af leukocytter, er en eftergivende kammer for væksten af M. marinum mutanter, som er stærkt svækket, når det injiceres i andre væv 7 (fig. 4F). Endelig tidlig injektion af M. marinum i blommen af embryoner tilvejebringer en alternativ metode til at opnå en systemisk infektion. Vi plejer at udføre disse injektioner omkring 16 celle stadiet (fig. 1G), men bakterielle injektioner i blommen kan også udføres på et senere tidspunkt (op til 1000 celle stadiet), eller tidligere (1 til 8 celle stadiet) for co-injektioner med morpholinos 8. Efter æggeblomme injektion af en dosis på 20-40 cfu, M. marinum bakterierne spredes over flere dage i de embryoniske væv og danner granuloma-lignende aggregater svarende til dem observeret ved den konventionelleintravenøs injektion fremgangsmåde 8; (fig. 4G). Blommen injektion metode er ikke egnet til S. typhimurium infektion, fordi dens hurtige vækst i blommen forårsager tidlig dødelighed. Blommen infektion fremgangsmåde til M. marinum infektion vil være nyttige til high-throughput applikationer, da det kan automatiseres ved hjælp af en injektion robot 8.

Figur 1
Figur 1. Oversigt over injektion metoder til indførelse af systemiske eller lokale infektioner i zebrafisk embryoer. (AB) Intravenøse injektioner for at etablere en hurtig systemisk infektion udføres i den kaudale vene ved den bageste blodet ø ved 1 dpf (A) eller ind i kanalen af Cuvier ved 2-3 dpf (B). (CE) Lokale injektioner for at studere makrofag og neutrofil kemotaksis udføres i baghjerne ventriklen ved 1 dpf (C), Halen musklen på 1-2 dpf (D) eller otisk vesikel ved 2-3 dpf (E). (F) injektioner for at skabe en infektion tilsyneladende utilgængelige for fagocytter udføres i rygstrengen på 1-2 dpf. (G) injektioner for at skabe en tidlig systemisk infektion med langsomvoksende bakterier, såsom M. marinum kan udføres i blommen ved 16-1000 cellestadiet. Alle billeder blev taget med et Leica M165C, PLANAPO 1.0x tilsluttet et Leica DFC420 kamera (Leica 10446307 0,8 x).

Figur 2
Figur 2. Hår loop værktøj. Et stykke af menneskehår indsættes som et loop i åbningen af ​​en Pasteur-pipette og fastgøres med super lim eller med Tipp-Ex. Dette giver et praktisk værktøj til forsigtigt at manipulere skrøbelige zebrafisk embryoner.

Figur 3
Figur 3. Intravenøse injektioner afrødt fluorescerende Salmonella typhimurium og Mycobacterium marinum. Ds-Red-mærket S. typhimurium SL1027 bakterier (AC) og mCherry-mærket M. marinum Mma20 bakterier (DE) blev injiceret i blodet ø Tg (MPEG1: Gal4-VP16) gl24, Tg (UAS-E1b: KAEDE) s1999t (AC) eller Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) zebrafisk embryoer ved 28 HPF. (A) Stereo-fluorescens og lyse-felt overlay billede, som viser udbredelsen af S. typhimurium i blodcirkulationen ved 2 HPI (Leica MZ16FA mikroskop med Leica DFC420C kamera). (BC) Konfokale z-stak prognoser, som viser rødt S. typhimurium bakterier fagocyteret af grønne makrofager ved 2 HPI (Leica TCS SPE, HCX APO objektiv 40x 0,8 NA). Bakterier, som stadig ekstracellulære kan også observeres. (D) Konfokal z-stak fremspring viser en granulom-lignende aggregat indeholdende M. marinum Mma20-smittede og ikke smittede makrofager ved 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0,8 NA). Makrofager i grøn og bakterier i rødt. (E) Konfokal z-stak projektion af en individuel makrofag (grøn) med intracellulære M. marinum bakterier (rød). Området er afbildet i D ved den hvide firkant blev afbildet med en højere forstørrelse mål (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 um.

Figur 4
Figur 4. Alternative ruter til infektion i zebrafisk embryoner. (A) mCherry-mærket M. marinum Mma20 bakterier blev injiceret i baghjerne ventrikel ved 32 HPF. Fluorescens og transmission overlay billede der viser mCherry-mærkede bakterier fagocyteret af makrofager ved 5 HPI (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium blev injiceret i halen musklen ved en dpf. Tiltrækning af myeloide celler til injektionsstedet (hvid cirkel), er vist ved 3 HPI af fluorescent in situ-hybridisering 4 (C) i ikke-injicerede embryoner der normalt ikke myeloide celler ved denne morfologiske site. Selv om embryonerne ikke indeholder modne neutrofile på dette stadium, kan to populationer af myeloide celler skelnes, en udtrykker makrofag markør mfap4 (rød) og en udtrykke neutrofil markør MPX (grøn) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0,3 NA). Fluorescens af bakterierne er tabt efter in situ-hybridisering procedure. (D) Ds-Red-mærket S. typhimurium bakterier blev injiceret i otisk vesikel af TG (MPX: EGFP) i114 zebrafisk ved 2 dpf. Stereo-fluorescens og lyse-felt overlejre billeder viser, at MPX: EGFP mærkede neutrofiler celler tiltrækkes til den inficerede otisk vesikel (punkteret ellipse) ved 3 HPI, (E), hvorimod kontrol injektion af PBS i otisk vesikel af TG (MPX: EGFP ) i114 zebrafisk viser ikke tiltrækning af neutrofiler til det inficerede otisk vesicle (stiplet ellipse) (Leica MZ16FA med Leica DFC420C kamera). (F) mCherry-mærket M. marinum bakterier af den svækkede E11 eccCb1 :: tn mutant stamme 17 blev injiceret i rygstrengen ved en dpf. Proliferation inden i rygstrengen blev afbildet ved 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskop med DC500 kamera). (G) mCherry-mærket M. marinum E11 bakterier blev injiceret i blommen af 16-celle stadiet zebrafisk embryoner af Tg (fli1a: EGFP) linje, der udtrykker GFP i endotelceller af blod-og lymfekar. Dannelse af granuloma-lignende aggregater af inficerede celler i haleregionen iagttages ved 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskop med Leica DFC420C kamera billede fra 8).

Discussion

De infektion metoder, der beskrives i denne artikel, er ofte bruges til at undersøge funktionen af vært medfødte immunitet gener eller bakterielle virulensgener 1. De intravenøse mikro-injektion metoder (protokoller 5 og 6.1) anvendes oftest til sådanne undersøgelser. Den kaudale vene ved den bageste blodet ø er den mest bekvemme sted for intravenøs injektion af 1 dag gamle embryoer. Som den kaudale vene bliver vanskeligere at trænge på senere stadier, foretrækker vi kanal Cuvier intravenøs injektionsstedet embryoer på 2-3 dpf. I alle tilfælde er det afgørende at injicere embryoner med konsekvente antal bakterier, der skal kontrolleres ved udpladning injektion inokula til cfu tælling. Følgende aspekter skal tages i betragtning for at opnå reproducerbare injektioner. For det første er det vigtigt at have høj kvalitet glas mikrokapillær injektionsnåle. Hvis nålespidsen er for stor, vil injektionen skabe en punktering hul stor nok til blødning forekommer ogDe injicerede bakterier vil strømme ud af blodcirkulationen. For det andet skal bakterier injiceres direkte ind i blodcirkulationen. Hvis nålespidsen ikke er inde i venen eller injektionsfluid spredes ind i blommesækken forlængelse skal embryo kasseres fra eksperimentet. For det tredje anvendelse PVP40 som en bærer til at indsprøjte M. marinum vil medvirke til at forhindre bakterier i at synke i glasset nålen. PVP40 forbedrer homogeniteten af ​​suspensionen, hvilket resulterer i mere reproducerbar inocula under hele injektioner. PVP40 kan også anvendes til S. typhimurium injektioner, men her er det mindre vigtigt, fordi den større størrelse og lyse fluorescens af bakterierne muliggør en visuel kontrol injektion inokulum under forsøg. For at praktisere injektionerne anbefaler vi brug af phenol rødt farvestof (1% v / v) eller 1 um fluorescerende kugler fås i forskellige farver (Invitrogen). Når teknikken er mestret, det tager cirka 30 minutES at injicere 50-100 embryoer, herunder tid, der kræves til at justere de embryoer på agaroseplader og justere den bakterielle injektionsvolumen.

Mens intravenøse injektioner i blodet ø (protokol 5) eller ind i kanalen af ​​Cuvier (protokol 6,1) er mest almindeligt anvendte, er de alternative ruter for infektion er beskrevet i denne video artiklen vist sig nyttigt at undersøge makrofag og neutrofil kemotaksi (protokoller 6,2, 6,3 og 6,4), til at studere vækst af svækkede bakterielle stammer (protokol 6,5), og at tilpasse zebrafisk infektionen model til high-throughput applikationer (protokol 6,6) 4-8. De beskrevne mikro-injektion fremgangsmåder kan også anvendes til injektion af vira 18, 19, svampesporer 14, 20 eller protozo-parasitter (Maria Forlenza, personlig kommunikation). En nyttig tilføjelse til injektion procedurerne beskrevet i denne video artikel er et nyligt beskrevet procedure til subkutan injektion af bakterier i zebrafish embryoer 21. Denne procedure blev anvendt til at studere fagocytose af bakterier fra neutrofiler, der blev fundet effektivt opsluge bakterier på vævsoverflader, men i modsætning til makrofager, var praktisk talt ude af stand til at fagocytere bakterier ved injektion ind i blodet eller i væskefyldte legemshuler. For subkutane injektioner embryoer er anbragt samme som for hale muskel injektioner som beskrevet i denne video artikel, men nålen indsættes lige under huden til at injicere de bakterier over en somit.

Det er vigtigt at overveje, at mikro-injektion er en kunstig rute for infektion. De tidlige embryoner er meget resistente over for ydre udsættelse for bakterielle patogener. Faktisk er nedsænkning assays, hvor embryoner er badet i en bakteriel suspension, ikke reproduceres i vores hænder 22. Mens nogle fostre kan blive smittet ved fordybelse, har vi observeret en stor variation i dødeligheden, og i den udtrykkeligeion af inflammatoriske markørgener mellem individuelle embryoer i sådanne assays. Mikro-injektion af fremgangsmåder beskrevet i denne artikel opnå reproducerbare infektioner og er især anvendelige til at studere bakterielle interaktioner med værtsceller medfødte immunceller. En effektiv metode til kvantificering af bakteriel infektion i de enkelte fostre er at analysere de fluorescerende billeder af inficerede fostre med custom-made, dedikeret pixel kvantificering software 17, 23. Denne fremgangsmåde har vist sig at korrelere godt med resultaterne af CFU tællinger efter udpladning af inficerede fostre. Tilsvarende har relative ændringer i leukocyt-numre pr embryo blevet kvantificeret af digital billedanalyse i transgene leukocytter fluorofor reporter linjer; denne fremgangsmåde ville være gældende for kvantificering værten leukopoietic respons på infektion 24.

Funktionen af værtsceller medfødte immunsystem gener kan undersøges effektivt in vivo ved at kombinere de beskrevne infektionsmodellermed morfolino knockdown. Morpholinos er syntetiske antisense-oligonukleotider, der er rettet mod specifikke RNA'er og reducere ekspressionen af genprodukter, når de injiceres ind i en-celle stadiet zebrafisk embryoer, som vist i andre videokilder artikler i tidsskriftet 10, 25. I morpholinogrupper Knockdown undersøgelser, er det af stor betydning, at alle embryonindsamlingsteam grupper, der skal sammenlignes er iscenesat korrekt forud for bakterielle injektioner. Dette er især vigtigt, fordi embryoer har en udvikling immunsystem, der bliver mere og mere kompetente over tid.

Der er flere transgene reporter linier i øjeblikket er tilgængelige til at adskille store medfødte immunsystem delmængder, makrofager og neutrofiler i zebrafisk embryoer. MPX og lyz promotorer er blevet anvendt til at generere neutrofil reportergener linier 16, 26, 27 og csf1r (FMS) og MPEG1 promotorer blev anvendt til fremstilling af makrofag reportere 14, 28. Mens CSF1r (FMS) er desuden udtrykt i xanthophores, MPEG1 udtryk er udelukkende i makrofager. Som vist i denne video artiklen de nyligt udviklede MPEG1 reporter linier er særdeles nyttige til billeddannelse bakteriel fagocytose af makrofager.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Chao Cui, Floor de Kort, Esther Stoop og Ralph Carvalho for billeder i figur 4, Ulrike Nehrdich og Davy de Witt til fisk pleje og andre lab medlemmer for nyttige diskussioner. Dette arbejde understøttes af Smart Mix Program for det nederlandske økonomiministerium og Ministeriet for Uddannelse, kultur og videnskab, Europa-Kommissionen 7. rammeprogram for projektet, ZF-SUNDHED (SUNDHED-F4-2010 til 242.048), den europæiske Marie Curie- Grunduddannelsen Netværk FishForPharma (PITN-GA-2011 til 289.209), og ved den australske NHMRC (637.394). Den australske regenerativ medicin Institut er støttet af tilskud fra staten regering Victoria og den australske regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Tags

Immunologi zebrafisk embryo medfødte immunitet makrofager infektion Salmonella Mycobacterium mikroinjektion fluorescensimagografi,
Infektion af zebrafisk embryoner med intracellulære bakterielle patogener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E. L., van der Sar, A. M.,… More

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter