Summary
Denne afhandling beskriver en protokol for hele kroppen hypertermi hos mus, som kan stimulere feber lignende forhold op til 12-24 timer.
Abstract
Hypertermi er en generel betegnelse anvendt til at definere forøgelse af kroppens kernetemperatur over det normale. Den anvendes ofte til at beskrive den forøgede kroppens kernetemperatur, som observeres i løbet af feber. Anvendelsen af hypertermi som adjuvans har vist sig som et lovende procedure for tumorregression inden for cancer biologi. Til dette formål er det vigtigste krav at have pålidelige og ensartet opvarmning protokoller. Vi har udviklet en protokol for hypertermi (hele kroppen) hos mus. I denne protokol blev dyrene udsat for cykler af hypertermi i 90 minutter efterfulgt af en hvileperiode på 15 minutter. I denne periode mus har let adgang til mad og vand. Høj kropstemperatur spidser i musene i første hypertermi eksponering cyklusser forhindres ved immobilisering af dyret. Derudover er normalt saltvand administreret i første cyklusser for at minimere virkningerne af dehydrering. Denne protokol kan simulere feber lignende forhold i mus op til 12-24 timer. Vi harbrugt 8-12 uger gamle BALB / Cj hunmus at demonstrere protokollen.
Protocol
1. Dyreetik
Inden du udfører langvarig hypertermi på mus sørge for, at proceduren er blevet godkendt af Institutional Animal Care og Use Udvalg. Alle de procedurer, der omtales i dette papir og vist i den ledsagende video blev godkendt af Institutional Animal Ethics Committee af National Institute of Immunology.
2. Forståelse Hypertermi
Whole Body Hypertermi (WBH) leveres ved at anbringe dyrene i forvarmede bure, der er placeret i inkubator holdt ved 39,5 ° C. Under standardisering af protokol blev en temperaturføler kirurgisk implanteret i musene, og deres legemstemperatur blev overvåget i forskellige eksperimentelle betingelser. Det blev observeret, at ved at anbringe dyrene i opvarmede omgivelser, deres temperatur øges gradvist fra 37 ° C til op til 42 ° C i løbet af varigheden af 100 min (fig. 1). The resulterende "spids" i temperatur er interessant som den indre kropstemperatur skudt endog højere end den ydre omgivende temperatur.
Når kropstemperaturen overstiger 40 ° C, ville dyret viser tegn på stress og dehydrering såsom befugtningsmidler omkring snuden. Øge kroppens temperatur over 40 ° C, vil føre til befugtning og irreversibel stress eller endda dyrenes død på grund af varmepåvirkningen. Det er derfor vigtigt at undgå, at temperaturen pigge i løbet af hypertermi.
Dette fænomen af højtemperatur spikes er forbundet med den fysiske hyperaktivitet af dyret under hypertermi eksponering. Lignende temperatur spidser blev observeret af andre grupper også og blev associeret med det fysiske hyperaktivitet af dyret ved at blive introduceret til miljøet med højere temperaturer 10.
I vores protokol, musene immobiliseres under hypertermi eksponering. Somvist i figur 2, immobilisering af dyr forhindrer temperaturen spikes.
Vi har anvendt 8-12 uger gamle BALB / cJ-mus til påvisning af denne protokol. Protokollen er ikke begrænset til en bestemt type / stamme af musene.
3. Forberedelse til eksperiment
3,1 Inkubator
Dette forsøg kan udføres i en normal CO2 inkubator da de har en god temperaturregulering. Afbryd CO 2 gasforsyning og fjern vandholdende bakke af CO 2 inkubator. I nogle modeller af kuvøser er det muligt at slukke for CO 2-controlleren. Arrangere hylderne i inkubatoren således, at en mus bur kan placeres hensigtsmæssigt inde. Indstil temperaturen af inkubator ved 39,5 ° C.
3,2 Bure
Typisk hypertermi forsøg udført på 4 mus ad gangen. To bure er påkrævet; påe er placeret inde i inkubatoren, og den anden er placeret udenfor ved stuetemperatur. Strøelse af bure undgås, da pletter af strøelse våd af tiden, hvilket resulterer i en uensartet temperatur inde i buret. Den udvendige bur skal have mad pellets og vandflaske.
3,3 Mus immobiliseringsteknikker rør
I løbet af de første 4 cyklusser af hypertermi mus immobiliseres i perforerede rør. Disse immobilisering rør kan fremstilles af 50 ml 'centrifugerør "rør af piercing 3 mm huller over hele sin krop og fire af disse rør være påkrævet. Den 50 ml rør kan hensigtsmæssigt immobilisere BALB / cJ-mus, der er ældre end 8 uger. Rør af passende størrelse kan være nødvendig for nogle usædvanligt anden stamme af mus eller mus, som er meget unge eller ældre end 50 uger.
Placer immobilisering rør og et bur inde i inkubator holdt ved 39,5 ° C. Vente i mindst to timer, således at buret og immobilization rør nå temperaturen i inkubatoren.
4. Første cyklus Hypertermi
Mus kan opleve dehydrering under hypertermi eksponering. Derfor, før du begynder eksperimentet, administrere 0,5 ml normalt saltvand intraperitonealt til hver mus. Brug en 26 G nål med 1 ml sprøjte.
Hurtigt tage ud buret placeret i rugemaskine, sted et dyr i hver immobiliseringsmetoder rør og placere buret tilbage i inkubatoren. Registrere tiden. Det er vigtigt at holde buret på samme sted i inkubatoren hver gang.
Efter 90 min, tag buret fra inkubatoren. Slip dyr fra flytningsrestriktionerne rør og placere dem i buret ved normal temperatur med nem adgang til mad og vand. Placere tomme immobilisering rør tilbage i inkubatoren.
Efter 15 minutter er den anden cyklus af hypertermi startet ved at levere 0.5 ml saltvand intraperitonealt til hver mus.
De er derefter immobiliseret i 50 ml perforerede immobilisering rør og placeret i inkubatoren.
5. Efterfølgende hypertermiske Cycles
For første 4 cyklusser, er det vigtigt at immobilisere musene under hypertermi eksponering og i de første to cyklusser, der saltvandsindsprøjtning givet, før du begynder hypertermi periode.
Efter disse cyklusser af hypertermi efterfulgt af resten er afsluttet, mus får akklimatisere og ikke bliver hyperaktive under hypertermi eksponering. Den intraperitoneale injektion af saltvand måske ikke nødvendig, hvis musene let tage mad og vand i den hviletid.
6. Efter alle de Cycles Fuldført, det sidste trin er at undersøge dyrene
Der bør ikke være nogen dødsfald i løbet af hypertermiske cykler. Hvert dyr skal overvåges meget nøje i den førstefå cykler. Hurtigt lede efter en befugtning omkring snuden. Dette symptom er en underskrift af dehydrering. Mus med sådanne symptomer bør straks gives 0,5 ml normalt saltvand ip og hvile ved stuetemperatur. De fleste af de immobiliserede mus vil ikke kræve yderligere pleje og vil med held bære fremhæver hypertermi.
Efter at have udfyldt de nødvendige cyklusser, kan dyrene se svag og dehydreret, men de vil hurtigt komme sig indenfor få timer.
Fig. 1. Variation af kernen kropstemperaturen hos mus, når buret blev anbragt i en inkubator ved 39,5 ° C. Efter 90 minutter buret blev fjernet fra inkubatoren og anbragt ved 25 ° C. Røde cirkler indikerer høj temperatur spikes.
Figur 2. Variation af kernelegemet temre af et immobiliseret Mus i de hypertermiske cyklusser. Efter immobilisering af dyret, blev høje temperaturer spikes ikke observere når buret blev placeret ved 39,5 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Så langt tilbage som 5.000 f.Kr., behandlet egyptiske læger tumorer med varme. Grækerne anerkendt værdien af varme i nogle medicinske behandlinger. De mest antikke tekster til Moseloven nævne hot springs (Første Mosebog 36:24) til terapeutisk hæve kropstemperaturen.
De tidligere anvendte teknikker enten brugen af pyrogene mikrobielle ekstrakter til induktion af feber eller varme vandbade til induktion af hypertermi 1. Men ingen af disse fremgangsmåder kan let overvåges eller kontrolleres. I vores protokol mus udsættes for hypertermi på kontrolleret og reproducerbar måde.
I denne procedure er det vigtigt at holde øje med mus i de to første cyklusser af hypertermi. Ved deres pels findes våd eller overdreven befugtning observeres omkring snuden, bør de straks få hvile og giver normalt saltvand intraperiotoneally at undgå dehydrering ved stuetemperatur.
telt "> Efter inddrivelsen Disse dyr kan udsættes for hypertermi igen. Det er interessant at bemærke, at efter 3-4 cykler af hypertermi fleste mus ikke bliver hyperaktive og de aktivt forbruge vand og mad i den resterende periode.Et par kliniske protokoller for brug af kunstig fremkaldt hypertermi i kræftbehandlingen er blevet udviklet i den seneste tid 4,9,11. Der er et par rapporter om brug af hypertermi er i forhold til tumorregression 3,5-8,12. I et nyligt papir,. Jia et al har brugt mikroovn til opvarmning til at eksponere dyrene til kort varighed (30 min) hele kroppen hypertermi 5. Den lange varighed (vedvarer nogle timer) hele kroppen hypertermi er en mere udfordrende procedure. Vi har beskrevet en meget enkel og billig protokol for langvarig hypertermi eksponering. Det er et meget lovende redskab til at udvikle en samlet strategi for behandling af kræft. Med større bevidsthed om enkelhed og anvendelighed of hypertermi procedure, kan det blive mere populær blandt forskere og klinikere 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermistor | RS components | 528-8558 | |
| CO2 Incubator | Heraeus | B5060 EK-CO2 | |
| Mice cages | Citizen industries ltd. | Type B 365X207X190 cm | |
| Animal feed | Provimi India | ||
| Water bottle for cage | Local supplier | Glass bottle | |
| Soldering iron | Solderon, India | ||
| 50 ml Centrifuge tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Timer | Local supplier | ||
| 1 ml Syringe with 26G needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Saline | Local supplier |
References
- Braude, A. I., Beck, J., Zalesky, M. Febrile response to bacterial pyrogens in leukemia. Blood. 16, 1279 (1960).
- Dovern, E. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy added to the treatment of ovarian cancer. A review of achieved results and complications. Eur. J. Gynaecol. Oncol. 31, 256 (2010).
- Gaworek, J., Mayer, C. T. Systemic whole body hyperthermia in oncology: fatal heat for tumor cells. Pflege. Z. 56, 15 (2003).
- Hegewisch-Becker, S. Effects of whole body hyperthermia (41.8 degrees C) on the frequency of tumor cells in the peripheral blood of patients with advanced malignancies. Clin. Cancer Res. 9, 2079 ( ).
- Jia, D. Inhibition of B16 murine melanoma metastasis and enhancement of immunity by fever-range whole body hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 27, 275 (2011).
- Maluta, S., Dall'oglio, S., Nadalini, L. Treatment for intermediate and high-risk prostate cancer: controversial issues and the role of hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 765 (2010).
- Moyer, H. R., Delman, K. A. The role of hyperthermia in optimizing tumor response to regional therapy. Int. J. Hyperthermia. 24, 251 (2008).
- Muthana, M., Multhoff, G., Pockley, A. G. Tumour infiltrating host cells and their significance for hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 247 (2010).
- Ostberg, J. R., Repasky, E. A. Comparison of the effects of two different whole body hyperthermia protocols on the distribution of murine leukocyte populations. Int. J. Hyperthermia. 16, 29 (2000).
- Pritchard, M. T. Protocols for simulating the thermal component of fever: preclinical and clinical experience. Methods. 32, 54 (2004).
- Repasky, E. A. Characterization of mild whole-body hyperthermia protocols using human breast, ovarian, and colon tumors grown in severe combined immunodeficient mice. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7, 19 (1999).
- Willnow, U. Treatment of otherwise incurable tumor diseases in childhood using whole-body hyperthermia and chemotherapy. Dtsch. Med. Wochenschr. 114, 208 (1989).
