Summary
हम एक नए प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए माउस मोटर न्यूरॉन्स में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो में भेदभाव की दक्षता में सुधार. विभेदित ES कोशिकाओं का अधिग्रहण मोटर न्यूरॉन्स सुविधाओं के रूप में neuronal और मोटर न्यूरॉन immunohistochemical तकनीक का उपयोग कर मार्करों की अभिव्यक्ति के द्वारा evidenced.
Abstract
कार्यात्मक मोटर न्यूरॉन्स में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) के प्रत्यक्ष भेदभाव रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए नई दवा यौगिकों स्क्रीन, और रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) के और amyotrophic पार्श्व काठिन्य के रूप में मोटर न्यूरॉन रोगों के लिए नए उपचारों के विकास के लिए एक आशाजनक संसाधन का प्रतिनिधित्व करता है ( ) ए एल एस. कई मौजूदा प्रोटोकॉल retinoic एसिड (आर ए) और ध्वनि हाथी (श्श्श) के एक संयोजन उपयोग में मोटर न्यूरॉन्स 1-4 माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एमईएस) में अंतर है. हालांकि, भेदभाव दक्षता एमईएस कोशिकाओं मोटर न्यूरॉन्स में केवल मध्यम सफलता के साथ मुलाकात की है. हम भेदभाव दो कदम 5 प्रोटोकॉल उल्लेखनीय है कि वर्तमान में स्थापित प्रोटोकॉल के साथ तुलना में भेदभाव दक्षता में सुधार विकसित किया है. पहला कदम के नोगिन और fibroblast वृद्धि कारक (FGFs) जोड़कर neuralization प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए है. नोगिन एक हड्डी morphogenetic प्रोटीन प्रतिपक्षी (बीएमपी) और तंत्रिका प्रेरण में फंसाneurogenesis के और पूर्वकाल तंत्रिका patterning के 6 के गठन में परिणाम का डिफ़ॉल्ट मॉडल को ccording. FGF संकेतन पीछे तंत्रिका 7-9 पहचान को बढ़ावा देने के द्वारा तंत्रिका ऊतक गठन उत्प्रेरण में नोगिन synergistically के साथ काम करता है. इस चरण में, एमईएस कोशिकाओं नोगिन, bFGF, और FGF-8 के साथ दो दिनों के लिए primed थे लिए तंत्रिका प्रजातियों के प्रति भेदभाव को बढ़ावा देने के. दूसरे चरण के लिए मोटर न्यूरॉन विनिर्देश प्रेरित है. नोगिन / MES कोशिकाओं उजागर FGFs आरए और श्श्श agonist, Smoothened की agonist (शिथिलता), के साथ एक और 5 दिनों के लिए incubated रहे थे मोटर न्यूरॉन पीढ़ी की सुविधा. मोटर न्यूरॉन्स में गंदगी के भेदभाव पर नजर रखने के लिए, हम एक ES सेल मोटर न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटर 1 Hb9 के नियंत्रण के अधीन एक ट्रांसजेनिक माउस व्यक्त EGFP से व्युत्पन्न लाइन का इस्तेमाल किया. इस मजबूत प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम 51 हासिल ± भेदभाव दक्षता के 0.8% (n = 3; पी <0.01, छात्र के टी - परीक्षण) 5. परिणाम के immunofluorescent सेधुंधला से पता चला है कि GFP + कोशिकाओं मोटर न्यूरॉन विशिष्ट मार्करों, आइलेट-1 और acetyltransferase choline (चैट) व्यक्त. हमारे दो कदम भेदभाव प्रोटोकॉल रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स में एमईएस कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करता है.
Protocol
1. चरण 1: माउस भ्रूणीय स्टेम सेल संस्कृति (एमईएस) (समय: 3 दिन)
1. चढ़ाना प्राथमिक भ्रूण माउस fibroblasts (PMEF)
- चार कोट PMEF आसंजन के लिए 100 मिमी ऊतक जेलाटीन के साथ संस्कृति व्यंजन. प्रत्येक पकवान 0.1% जेलाटीन समाधान (StemCell टेक्नोलॉजीज) के 8 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- बर्तन से जेलाटीन अतिरिक्त निकालें. बर्तन नहीं कुल्ला.
- पतला mitomycin सी. निष्क्रिय PMEF (Millipore) की एक शीशी है कि लगभग है. 5 x 10 PMEF मीडिया के 40 मिलीलीटर में 6 कोशिकाओं (तालिका 1 में नुस्खा देखें) और चार 100 एमएम ऊतक संस्कृति बर्तन पर थाली. PMEF एमईएस कोशिकाओं के लिए एक फीडर परत प्रदान करते हैं.
- PMEF एमईएस सेल संस्कृतियों को जोड़ने से पहले कम से कम एक दिन चढ़ाया जाना चाहिए. PMEF चढ़ाना के बाद 1 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. चढ़ाना एमईएस कोशिकाओं
मोटर न्यूरॉन्स के में एमईएस सेल भेदभाव की क्षमता की निगरानी, हम HBG3 एक ES सेल मोटर न्यूरॉन के विशिष्ट Hb9 प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन एक ट्रांसजेनिक माउस व्यक्त EGFP से प्राप्त लाइन का इस्तेमाल किया.
- डीफ्रोस्ट HBG3 एमईएस कोशिकाओं के 1 (एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक लगभग 10 x 7, डॉ. डगलस Kerr, जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय द्वारा योगदान) शीशी. जोड़ें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ते मीडिया (तालिका 1 में नुस्खा देखें) 5 मिलीग्राम और 5 मिनट के लिए 800 rpm पर नीचे कोशिकाओं स्पिन.
- महाप्राण (व्यंजन) सतह पर तैरनेवाला और हौसले से 10 एनजी / मिली की एक अंतिम एकाग्रता में लेकिमिया निरोधात्मक कारक (lif) के साथ ES मीडिया के 20 मिलीलीटर में resuspend एमईएस कोशिकाओं. नोट: LIF उपयोग के दिन पर जोड़ा जाना चाहिए और एक undifferentiated राज्य में एमईएस कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए आवश्यक है.
- प्रत्येक पकवान में PMEF से 10 मिलीलीटर PMEF मीडिया निकालें और प्रत्येक पकवान HBG3 ES सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
- चढ़ाना के बाद 24 घंटे, एमईएस कोशिकाओं छोटी कालोनियों, आकार में चित्रा 1 बी में नोक ने संकेत दिया कॉलोनी के लिए इसी तरह के रूप में. चढ़ाना के बाद 72 घंटे, coloniतों के आकार में वृद्धि हुई है, कई व्यास में लगभग 100 माइक्रोन (चित्रा 1 बी, तीर द्वारा संकेत दिया) जा रहा है. इन कोशिकाओं को भेदभाव के लिए तैयार हैं. मीडिया दैनिक प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए कोशिकाओं के प्रसार को बनाए रखने.
2. चरण 2: तंत्रिका प्रेरण (समय: 2 दिन)
मोटर न्यूरॉन्स में एमईएस कोशिकाओं की भेदभाव प्रेरित, एमईएस कोशिकाओं PMEF से अलग हो सकता है और एक निलंबन पर्यावरण में खेती की जरूरत है. जिलेटिन में लिपटे बोतल के एमईएस कोशिकाओं से PMEF अलग किया जाता है.
- एमईएस कालोनियों तंत्रिका प्रेरण (भेदभाव 0 दिन के रूप में परिभाषित), कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.1% जेलाटीन (18 मिलीग्राम / फ्लास्क) के साथ 2 T150 बोतल कोट के लिए तैयार हैं और फिर अतिरिक्त जेलाटीन हटाने के लिए और 1x पीबीएस तीन बार से धो. नोट: 100 मिमी प्रत्येक पकवान संस्कृति T150 जिलेटिन लेपित कुप्पी की जरूरत है PMEF अलग.
- ध्यान से आकांक्षा से मीडिया को निकालने के लिए, शिथिल संलग्न कालोनियों नहीं जगह देना सुनिश्चित करने के. 10 मिलीलीटर पीबीएस संक्षिप्त जोड़ेंly और फिर आकांक्षा से दूर धोने के कदम को पूरा करने के लिए.
- PMEF से एमईएस कोशिकाओं को अलग करने के लिए, 0.25% जोड़ने से trypsin / EDTA (3 मिलीग्राम / पकवान, StemCell की प्रौद्योगिकी) और 37 पर 3-5 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस तक स्टेम कोशिकाओं और PMEF थाली से अलग है. LIF और pipet कोशिकाओं के बिना 15 मिलीलीटर ताजा ES मीडिया जोड़ें ऊपर और नीचे कालोनियों (15-20 गुना) को तोड़ने. तो, एक 0.1% जिलेटिन में लिपटे T150 फ्लास्क को जोड़ने के लिए और 37 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के बाद, PMEF gelatinized सतह के लिए देते हैं, जबकि ES कोशिकाओं चल जाना चाहिए. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में चल एमईएस कोशिकाओं को इकट्ठा.
- 800 rpm और resuspend कोशिकाओं में तंत्रिका भेदभाव मध्यम की 10 मिलीलीटर में नीचे स्पिन (तालिका 1 में नुस्खा देखें).
- एक 100 मिमी बैक्टीरियल या निलंबन संस्कृति पकवान पर एक hemocytometer और फिर थाली लगभग 2 x 10 6 एमईएस कोशिकाओं का उपयोग कर कक्षों गिनो. इन प्लेटों निलंबन संस्कृतियों के विकास की अनुमति है और embryoid निकायों (यूके) के गठन को बढ़ावा देने के.
- वैशिष्ट्य परtion 1 दिन, एमईएस कोशिकाओं छोटे चल (यूके) समुच्चय है कि एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहे हैं के रूप में. कोई carryover PMEF डिश के लिए देते हैं. एक 15 मिलीग्राम और 3 मिनट के लिए कम गति (500 आरपीएम) ट्यूब अपकेंद्रित्र में निलंबन कोशिकाओं और मीडिया हस्तांतरण. मीडिया ध्यान से महाप्राण (व्यंजन), pelleted ईबीएस ताजा तंत्रिका भेदभाव मध्यम की 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और फिर एक नया बैक्टीरियल पकवान में थाली की कोशिकाओं. मीडिया की भरपाई के अलावा, इस कदम है कि पहले कदम से आगे ले जाना किसी भी PMEF हटा.
- भेदभाव 2 दिन, ईबीएस मोटर न्यूरॉन्स में प्रेरित किया जा करने के लिए तैयार हैं.
3. चरण 3: मोटर न्यूरॉन विशिष्टता (समय: 5 दिन)
- भेदभाव 2 दिन, संस्कृति पकवान ज़ुल्फ़ और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मीडिया और ईबीएस हस्तांतरण पर. ईबीएस गुरुत्वाकर्षण (~ 10 मिनट) या 3 मिनट के लिए कम गति (500 आरपीएम) पर centrifugation द्वारा बसा.
- मध्यम ध्यान और resuspend ईबीएस मोटर न्यूरॉन भेदभाव के 10 मिलीग्राम (MND) मध्यम (नुस्खा में महाप्राण (व्यंजन)
- 200 माइक्रोन व्यास में और मजबूत GFP संकेत (चित्रा 1C) व्यक्त करना चाहिए भेदभाव 7 दिन, ईबीएस लगभग 150 होना चाहिए. इन ईबीएस लेपित बर्तन या coverslips के poly-DL-ornithine/laminin पर अलग और मढ़वाया बनने के लिए तैयार हैं.
4. चरण 4: Poly-DL-ornithine/laminin लेपित Coverslips की तैयारी (समय: 2 दिन)
ईबीएस dissociating से दो दिन पहले (यानी भेदभाव 5 दिन पर), poly-DL-ornithine/laminin-coated coverslips तैयार.
- जगह एक 24 अच्छी तरह से थाली के तल पर 12 मिमी दौर coverslips (वार्नर उपकरण). 25 मिलीग्राम 25 मिलीलीटर में पाली डीएल-ओर्निथिन (सिग्मा Aldrich) बाँझ, दोहरा आसुत पानी (2 डी 2 एच ओ) को भंग करने के लिए एक 10X स्टॉक के समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) प्राप्त करने के लिए. जब का उपयोग करने के लिए तैयार, 1/10 पाली डीएल-ओर्निथिन की एक कमजोर पड़ने के साथ घ 2 एच 2 हे बनाने के लिए concent प्राप्तराशन का 100 / μg मिलीलीटर. 4 में 24 अच्छी तरह से थाली और सेते हैं की हर अच्छी तरह से डिग्री सेल्सियस के लिए रात भर के लिए 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- निम्नलिखित दिन (6 दिन भेदभाव), पाली डीएल-ओर्निथिन महाप्राण (व्यंजन) और एक ऊतक संस्कृति हुड में प्लेटें और कवर निकल जाता है शुष्क हवा. घ 2 एच 2 हे तीन बार के साथ थाली कुओं कुल्ला. एक घंटे के लिए हवा शुष्क करते हैं.
- 5 मिलीलीटर में आइस्ड ठंड 1X पीबीएस के 1 मिलीग्राम माउस laminin (Millipore) को भंग करने के लिए 100x स्टॉक समाधान (200 / μg मिलीलीटर). जब का उपयोग करने के लिए तैयार है, आइस्ड ठंड 1X पीबीएस (laminin 2 μg / एमएल) में 1/100 मन्दन. 0.5 मिलीग्राम / 24 अच्छी तरह से और 4 में थाली सेते हैं डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए. बोने की कोशिकाओं से पहले, अतिरिक्त laminin और हटाया जाना चाहिए कुओं 1X पीबीएस के साथ दो बार से rinsed है. Coverslips MND मध्यम (0.5 मिलीलीटर अच्छी तरह /) में संग्रहीत किया जा सकता है.
5. चरण 5: Axon बढ़ाव (समय: 2 दिन)
- भेदभाव 7 दिन, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ईबीएस इकट्ठा और ईबीएस (लगभग 3 मिनट) को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. महाप्राण (व्यंजन) मीडिया और फिरपीबीएस में uspend ईबीएस. ईबीएस व्यवस्थित करने और फिर पीबीएस महाप्राण (व्यंजन) की अनुमति दें. इस कदम 3 बार दोहराएँ. ईबीएस Accumax Millipore () के 1 मिलीग्राम, धीरे मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. तो अतिरिक्त Accumax ईबीएस कवर महाप्राण (व्यंजन).
- ईबीएस अलग कर देना, MND मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें. Pipet और नीचे 20 बार 1 मिलीग्राम Eppendorf micropipette (नीला टिप) का उपयोग करने के लिए ईबीएस बाधित. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं. सेल छलनी टोपी (बी फाल्कन) के साथ एक 12x75 मिमी ट्यूब सेल निलंबन के लिए एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त स्थानांतरण. शेष clumps और कोशिकाओं को इतना के रूप में एकल कक्षों की उपज को समृद्ध करने के लिए फिल्टर द्वारा बनाए रखा के साथ इस हदबंदी कदम दोहराएँ. अंतिम एकल कोशिका निलंबन 6 मिलीग्राम होगा.
- धीरे इस एकल कोशिका निलंबन और मिश्रण कोशिकाओं गिनती hemocytometer का उपयोग. MND मध्यम (10 / प्रत्येक BDNF का एनजी मिलीलीटर, GDNF, CNTF, और NT-3 के साथ पूरक) में कोशिकाओं 2x10 5 मिलीग्राम प्रति कोशिकाओं के घनत्व के लिए पतला. 24 अच्छी तरह से पुलिस युक्त प्लेटों के लिए सेल निलंबन (0.5 मिलीलीटर अच्छी तरह /) जोड़ेंly-DL-ornithine/laminin लेपित coverslips (पहले से तैयार के रूप में ऊपर वर्णित). विभेदित कोशिकाओं संस्कृति में 2 दिन (चित्रा 1D) के बाद लंबे समय neurites विस्तार.
6. प्रतिनिधि परिणाम
आंकड़ा 1A प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा से पता चलता है. चरण 1 में, एमईएस कोशिकाओं PMEF पर खेती कर रहे हैं और LIF के साथ पूरक करने के लिए सहज भेदभाव को रोकने के. सामान्य में, undifferentiated एमईएस कालोनियों गोल और कॉम्पैक्ट हैं, और स्पष्ट रूप से परिभाषित किनारों. कालोनियों एक दूसरे के साथ संपर्क में नहीं हैं. आमतौर पर, एमईएस कोशिकाओं एक 1:04 के अनुपात में हर 2 ~ 3 दिनों अलग होना चाहिए. हालांकि, प्रत्येक व्यक्ति सेल लाइन एक अलग दर से बढ़ने और विभाजन अनुपात empirically का निर्धारित किया जाना चाहिए. चित्रा 1 बी में तीर 3 दिनों के लिए एक PMEF फीडर परत पर संवर्धन बाद एमईएस कोशिकाओं की विशिष्ट उपस्थिति का संकेत मिलता है. इन कालोनियों में बड़े हैं (व्यास में 50-100 माइक्रोन), लेकिन अभी दौर और परिभाषित बढ़त को बनाए रखनेहै. इस स्तर पर कालोनियों भेदभाव या उपसंस्कृति के लिए तैयार हैं. चित्रा 1 बी में एक नोक के एक छोटे से एमईएस कॉलोनी है कि आप आम तौर पर चढ़ाना के बाद 24 घंटे से पता चलता है. चढ़ाना के बाद चार दिन, में एमईएस कोशिकाओं को ऊंचा हो गया हो. वे एक चपटी उपस्थिति और परिभाषित सीमाओं के नुकसान दिखाने के लिए, यह दर्शाता है कि वे अलग करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं. ऐसी कोशिकाओं neuronal कोशिकाओं में भेदभाव के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं.
एमईएस कोशिकाओं मोटर न्यूरॉन्स में अंतर, एमईएस कोशिकाओं को निलंबन की स्थिति में खेती की जानी चाहिए EB के गठन की अनुमति. चरण 2 में, एक संस्कृति की सतह पर ES कोशिकाओं EB के गठन को बढ़ावा देने के लिए एक फीडर परत के बिना स्थानांतरित कर रहे हैं. इस चरण में, वे तंत्रिका भेदभाव नोगिन, bFGF, और FGF-8 के साथ एक तंत्रिका वंश के लिए प्रत्यक्ष कोशिकाओं को 2 दिन के लिए पूरक मध्यम में incubated हैं. स्मॉल ईबीएस भेदभाव के एक दिन में खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है. वे मध्यम में चल जाना चाहिए. Carryover PMEF 1 दिन में भी पाया जा सकता हैभेदभाव की और हटा दिया जाना चाहिए. इन कोशिकाओं जीवाणु जब ईबीएस एक नया बैक्टीरिया पकवान passaged का सफाया कर रहे हैं व्यंजन का पालन. इस प्रकार, भेदभाव के 2 दिन के द्वारा, कुछ या कोई PMEF संस्कृति डिश में देखा जाना चाहिए. चरण 3 में जारी रखा है, है ईबीएस का नया व्यंजन करने के लिए स्थानांतरण किसी भी शेष PMEF हटाने को यह सुनिश्चित करना चाहिए. ईबीएस मोटर न्यूरॉन भेदभाव (MND) आरए के साथ पूरक मीडिया में संवर्धित कर रहे हैं और 5 दिनों के लिए शिथिलता मोटर न्यूरॉन्स में कोशिकाओं को अलग. संस्कृति के दौरान, ईबीएस आकार में वृद्धि जारी है और नग्न आंखों से भेदभाव 3 दिन में देखा जा सकता है ~ 4 चित्रा 1C भेदभाव 7 दिन ईबीएस की सूक्ष्म उपस्थिति से पता चलता है. Undifferentiated कोशिकाओं के विपरीत, ईबीएस मजबूत GFP की अभिव्यक्ति के कारण प्रतिदीप्ति दिखा. इन ईबीएस बेहतर भेदभाव कर रहे हैं और पृथक्करण के लिए तैयार हैं. प्रवाह cytometry से पता चला है कि 51 ±% अलग ईबीएस से कोशिकाओं के 0.8% से GFP में भेदभाव था कोशिकाओं 5 व्यक्त. चरण 5 वीं की संस्कृति मेंese GDNF, CNTF, BDNF, और लंबी axonal के अनुमानों के विस्तार में NT3 परिणाम की उपस्थिति में मोटर न्यूरॉन्स. चित्रा 1D अलग ईबीएस की चढ़ाना के बाद 2 दिन विभेदित कोशिकाओं की उपस्थिति को दर्शाता है. लंबे समय से मढ़वाया कोशिकाओं के सेल शरीर से विस्तार neurites ध्यान दें. Immunofluorescent धुंधला से पता चलता है कि GFP + कोशिकाओं अखिल neuronal मार्कर (श्रृंखला neurofilament मध्यम) और दो मोटर न्यूरॉन विशिष्ट मार्करों, (आइलेट-1 और acetyltransferase choline, चित्रा 2) व्यक्त.
चित्रा 1 एमईएस कोशिकाओं मोटर न्यूरॉन्स (चित्र वू एट अल से संशोधित 5.) में भेदभाव है. भेदभाव एमईएस कोशिकाओं से मोटर न्यूरॉन्स के लिए प्रोटोकॉल के एक स्कीम). बी) undifferentiated एमईएस कोशिकाओं fibroblast फीडर परत के शीर्ष पर दौर कालोनियों के रूप में. वे कमजोर GFP अभिव्यक्ति है. सी एम) कोशिकाओं फीडर परतों और cultu से अलग हो गए थेकम लगाव बर्तन पर लाल ईबीएस फार्म. भेदभाव प्रक्रिया के पहले दो दिनों के दौरान, कोशिकाओं 50 एनजी / मिलीलीटर नोगिन, 20 एनजी / एमएल bFGF, और 20 / एनजी FGF-8 मिलीग्राम से अवगत कराया गया. बाद में, वे के लिए एक माइक्रोन retinoic एसिड और 1 माइक्रोन 5 दिनों के लिए ध्वनि का हाथी agonist के शिथिलता के साथ अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया. विभेदित एमईएस कोशिकाओं को मजबूत GFP प्रतिदीप्ति. डी) 7 दिन भेदभाव के बाद, ईबीएस अलग और poly-DL-ornithine/laminin लेपित प्लेट पर चढ़ाया थे. विभेदित कोशिकाओं संस्कृति में 2 दिनों के बाद लंबे समय तक तंत्रिका प्रक्रियाओं बढ़ाया. पैमाने बार = 200 माइक्रोन. एम.एन. = मोटर न्यूरॉन. बी, सी और डी उज्ज्वल क्षेत्र छवियों हैं और बी, सी और डी 'इसी प्रतिदीप्ति छवियाँ हैं.
चित्रा 2 एमईएस सेल व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स की विशेषता. Neurofilament मध्यम श्रृंखला (NF एम, लाल), (लाल) चैट, और आइलेट-1 (लाल) के लिए immunofluorescence धुंधला GFP expr (हरा) के साथ संपाती थाession. DAPI (नीला) करने के नाभिक की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया था. पैमाने बार = 50 माइक्रोन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
एमईएस कोशिकाओं की गुणवत्ता मोटर न्यूरॉन्स के कुशल पीढ़ी के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्राचल है. एमईएस कोशिकाओं PMEF पर खेती किया जाना चाहिए सहज भेदभाव को रोकने के. LIF के अलावा एक undifferentiated राज्य में एमईएस कोशिकाओं को बनाए रखने में मदद करता है. एमईएस कोशिकाओं के रूप में हर 12-15 घंटे, विभाजित संस्कृति के माध्यम तेजी से समाप्त हो जाता है और दैनिक प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.
श्श्श मार्ग के कुशल सक्रियण एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के लिए मोटर न्यूरॉन विनिर्देश को प्रेरित करने के लिए की जरूरत है. श्श (आर एंड डी प्रणाली), प्रोटीन, और Hh HhAg1.3 (Curis, Inc) agonist के है, purmorphamine (Calbiochem), और शिथिलता (ईएमडी रसायन) के रूप में श्श्श संकेत agonists के सभी मोटर न्यूरॉन्स 1-3 के गठन को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है 10,11,. हम एक मोटर neuronal 5 phenotype की ओर फर्क कोशिकाओं में purmorphamine की तुलना में एक अधिक प्रभावी अणु शिथिलता पाया. 1 - 1 माइक्रोन आरए के साथ 2.5 माइक्रोन purmorphamine दिया कभी नहीं से अधिक 20% की एक भेदभाव दक्षता के. तथापिहमारे हाथ में आरए के 1 माइक्रोन और शिथिलता के 1 माइक्रोन का एक संयोजन एक तंत्रिका प्रेरण कदम के बिना प्रक्रिया में लगभग 25% की एक भेदभाव दक्षता के दे दिया.
आगे भेदभाव दक्षता बढ़ाने के लिए, हम मोटर न्यूरॉन विनिर्देश कदम से पहले एक 2 दिन तंत्रिका प्रेरण कदम जोड़ें. इस दृष्टिकोण तथ्य यह है कि दोनों नोगिन और FGF संकेतन तंत्रिका शामिल करने के प्रारंभिक चरण के लिए महत्वपूर्ण हैं जब भ्रूण कोशिकाओं के पहले तंत्रिका 6-9 वंश में प्रवेश का लाभ लेता है. तंत्रिका प्रेरण के अलावा, FGF संकेतन तंत्रिका कोशिकाओं के अग्रदूत के रूप में संस्कृतियों का कहना है. Fgf8 की विकासशील मध्यमस्तिष्क में overexpression निलय 12 क्षेत्र में एक तंत्रिका अग्रदूत साबित जनसंख्या के नाटकीय विस्तार करने के लिए ले जाता है. FGFs और नोगिन का एक संयोजन एक पीछे तंत्रिका 9 पहचान को बढ़ावा देने के द्वारा तंत्रिका ऊतक गठन उत्प्रेरण में synergistically काम करता है. इस प्रकार 2 दिन तंत्रिका प्रेरण कदम की ओर एमईएस कोशिकाओं प्रत्यक्ष बनाया गया हैतंत्रिका वंश मोटर न्यूरॉन विनिर्देश की प्रक्रिया की दीक्षा से पहले.
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक संशोधन और मूल स्थापित प्रोटोकॉल की वृद्धि एक पहले से वर्णित है. हालांकि मोटर न्यूरॉन्स पैदा करने के समय एक ही है, हम संशोधनों के एक नंबर के लिए प्रक्रिया को सरल बनाने और मोटर न्यूरॉन्स की उपज में सुधार किया है. एक तंत्रिका प्रेरण भेदभाव प्रोटोकॉल करने के लिए कदम को जोड़ कर, हम 25% से 50% करने के लिए भेदभाव दक्षता बढ़ाने के लिए कर रहे हैं. हमारे प्रोटोकॉल एमईएस कोशिकाओं से व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स को समृद्ध करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है. मोटर न्यूरॉन्स SMA रोगियों से प्राप्त नहीं कर सकते हैं और SMA चूहों से प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स के गरीबों के स्वास्थ्य की पर्याप्त मात्रा, गुणवत्ता, और इस रोग में प्रभावित प्रोटीन की मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए शुद्धता की कोशिकाओं के अलगाव को अलग करता है. इस एमईएस सेल प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम पर्याप्त क्वान की एक मोटर न्यूरॉन सेल जनसंख्या प्राप्त करने में सक्षम थेऔर प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष में 5 प्रभावित आणविक रास्ते की पहचान के लिए tity पवित्रता.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह पांडुलिपि जो 26 मई, 2011 को निधन हो गया डॉ. Wenlan वांग की स्मृति को समर्पित है. हम उदारता HBG3 एमईएस इस अध्ययन में इस्तेमाल किया कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए डॉ. डगलस ए Kerr धन्यवाद. इस काम Nemours के द्वारा वित्त पोषित किया गया था, अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र (NCRR), और NCRR से Cobre अनुदान पुरस्कार (5 P20 RR020173-05) के लिए केंद्र का समर्थन INBRE कार्यक्रम के तहत अनुदान (2 RR016472 - 10) अल्फ्रेड मैं ड्यूपॉन्ट अस्पताल में बाल चिकित्सा अनुसंधान बच्चों, Wilmington, डेलावेयर, संयुक्त राज्य अमेरिका के लिए.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMEF | EMD Millipore | PMEF-H | N.A. |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | EMD Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | EMD Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | Stem Cell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Millipore | 566660 | 1 μM |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation | |||
| 0.1% Gelatin | Stem Cell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | EMD Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | EMD Millipore | SCR006 | N.A. |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 2. Reagents for coating and dissociation | |||
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
